Gadd45b在缺血性脑卒中和卒中后脑可塑性中的作用

发布时间：2018-08-20 08:28

【摘要】：目的:生长阻断及DNA损伤诱导因子45b(Growth arrest and DNA-damage inducible protein beta,Gadd45b)属于Gadd45家族,被证实与神经元活动有关,这与神经的发生密切的相关。大鼠的脑缺血再灌注损伤可以诱导Gadd45b在蛋白和核酸水平的表达,Gadd45b介导了神经元的凋亡,可能与轴突可塑性和卒中后脑康复有关。细胞的死亡方式包括了凋亡、自噬和坏死。自噬性细胞死亡作为II型程序性细胞死亡,被证实参与了脑缺血再灌注损伤这一病理过程。然而,在此病理过程中Gadd45b对自噬的作用并不清楚。此外,在脑缺血中,Gadd45b可以促进脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表达,与轴突的可塑性而相关,Gadd45b在脑缺血中可能起着促进康复的作用。然而,在脑缺血病理过程中,Gadd45b表达的分子调控机制尚不清楚。泛素-蛋白酶系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)广泛调控了细胞内蛋白的降解。Gadd45的表达受到了泛素化方式的调控。但是,脑缺血再灌注损伤如何诱导Gadd45b表达及所涉及的具体机制也不清楚。本研究以进一步探讨和分析在脑缺血再灌注损伤的病理过程中Gadd45b对自噬的作用和可能的作用机制,以及泛素化系统Huwe1对Gadd45b的作用,以及两者在卒中后脑可塑性中的作用机制。方法:采用大鼠皮层神经元原代培养,并予以缺氧缺糖/再灌注处理(oxygen-glucosedeprivationandreperfusion,ogd/r),即ogd3h和再灌注0h、6h、24h、48h、72h和120h。cck-8和ldh试剂盒用于检测皮层神经元的细胞活性和损伤情况。构建慢病毒shrna-gadd45b沉默gadd45b的表达,利用蛋白印迹技术检测自噬分子(atg5、lc3、beclin-1、atg7、atg3)、凋亡通路分子(bax、bcl-2、cleavedcaspase3、p53)以及jnk/p38信号通路的表达变化。同时,给予自噬抑制剂或jnk/p38通路抑制剂共处理,检测相关分子的蛋白表达变化情况,并利用tunel技术检测皮层神经元细胞的凋亡情况。利用神经元标记物tuj1和lc3b免疫荧光染色双标技术检测神经元的轴突损伤。此外,构建慢病毒shrna-huwe1沉默huwe1的表达变化,采用co-ip检测huwe1和gadd45b的相互作用,进行chx处理检测huwe1对gadd45b蛋白稳定性的分析,采用bsp检测huwe1和gadd45b对bdnfixa甲基化的作用,采用westernblot技术检测huwe1和gadd45b对bdnf及其受体trkb和p75ntr和下游效应分子的影响。结果:在ogd/r处理神经元细胞后,皮层神经元的细胞活性降低,随着再灌注时间的延长而逐渐降低。gadd45b在ogd/r24h时表达最高,给予慢病毒shrna沉默gadd45b后,gadd45b在再灌注24h时表达明显的降低,增加了自噬通路的信号分子(beclin-1、atg5、atg7和atg3)、lc3ii/lc3i的比值和凋亡蛋白bax和cleavedcaspase3的表达,但是降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。与此同时,慢病毒shRNA-Gadd45b和自噬通路抑制剂3-MA或Wortmannin共处理后,可部分抑制LC3 II/LC3 I的比例,轻微缓解了神经元的凋亡。沉默Gadd45b表达后,自噬相关通路p-p38磷酸化水平降低,而凋亡相关通路p-JNK磷酸化水平增加。给予慢病毒shRNA-Gadd45b和p38通路抑制剂共处理后则明显诱导了自噬,而给予慢病毒shRNA-Gadd45b和JNK通路抑制剂共处理后则明缓解了细胞凋亡。OGD/R 24 h后,沉默Huwe1表达后明显增加了Gadd45b和BDNF的表达。CO-IP结果表明Huwe1和Gadd45b存在相互作用。通过CHX处理后抑制了内源性的Gadd45b的表达,CHX和慢病毒shRNA-Huwe1共处理后则增加了Gadd45b的表达。慢病毒shRNA-Gadd45b处理后降低了BDNF和下游效应分子的表达,而慢病毒shRNA-Huwe1处理后增加了BDNF和下游效应分子表达。沉默Huwe1表达后降低了BDNF IXa第五个CpG岛甲基化水平,而沉默Gadd45b表达后则增加了BDNF IXa第四个CpG岛甲基化水平。结论:在皮层神经元OGD/R的病理过程中Gadd45b调节了凋亡和自噬,Gadd45b的表达受到了泛素-蛋白酶体系统Huwe1的调节,Gadd45b和Huwe1介导了BDNF IXa的甲基化。这可能为缺血性脑卒中的病理过程的研究提供新的理论基础,为日后的临床治疗提供可能的靶点。
[Abstract]:AIM: Growth arrest and DNA-damage inducible protein beta (Gadd45b) belongs to the Gadd45 family and has been proved to be associated with neuronal activity, which is closely related to neurogenesis. Neuronal apoptosis may be associated with axonal plasticity and post-stroke rehabilitation. Cell death patterns include apoptosis, autophagy and necrosis. Autophagic cell death, as a type II programmed cell death, has been shown to be involved in the pathological process of cerebral ischemia-reperfusion injury. However, the role of Gadd45b in autophagy is not apparent during this pathological process. In addition, Gadd45b can promote the expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) in cerebral ischemia, which is related to the plasticity of axons. Gadd45b may play a role in promoting rehabilitation in cerebral ischemia. Ubiquitin-proteasome system (UPS) regulates the degradation of intracellular proteins extensively. Gadd45 expression is regulated by ubiquitination. However, how the expression of Gadd45b is induced by cerebral ischemia-reperfusion injury and the specific mechanisms involved are unclear. This study aims to further explore and analyze the role of UPS in cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods: Rat cortical neurons were primary cultured and treated with oxygen-glucose deprivation and reperfusion (og). D / r, i.e. ogd3h and reperfusion 0h, 6h, 24h, 48h, 72h and 120h. CCK-8 and LDH kits were used to detect the activity and damage of cortical neurons. lentivirus shrna-gadd45b was constructed to silence the expression of gadd45b, and autophagy (atg5, lc3, beclin-1, atg7, atg3), apoptotic pathway molecules (bax, bcl-2, cleaspase 3, p53) were detected by Western blotting. At the same time, autophagy inhibitors or JNK / p38 pathway inhibitors were given to detect the expression of related molecules, and TUNEL technique was used to detect the apoptosis of cortical neurons. In addition, the expression of huwe1 was silenced by lentivirus shrna-huwe1, the interaction between huwe1 and Gadd45b was detected by co-ip, the stability of Gadd45b was analyzed by CHX treatment, the methylation of bdnfixa by huwe1 and Gadd45b was detected by bsp, and the effect of huwe1 and Gadd45b on BDNF and BDNF was detected by Western blot. Results: After treatment with OGD / r, the activity of cortical neurons decreased gradually with the prolongation of reperfusion time. The expression of Gadd45b was the highest at 24 hours of OGD / r24. After silencing Gadd45b with lentivirus shrna, the expression of Gadd45b was significantly decreased and increased at 24 hours of reperfusion. The autophagy pathway signaling molecules (beclin-1, atg5, Atg7 and atg3), the ratio of lc3ii / lc3i and the expression of apoptotic proteins Bax and cleavedcaspase 3 were decreased, but the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 was decreased. At the same time, the co-treatment of lentivirus shRNA-Gadd45b and autophagy pathway inhibitor 3-MA or Wortmannin partially inhibited the ratio of LC3 II / LC3 I. After silencing the expression of Gadd45b, the phosphorylation level of p-p38 in the autophagy-related pathway decreased, while that of p-JNK in the apoptosis-related pathway increased. Co-treatment with lentivirus shRNA-Gadd45b and p38 pathway inhibitors significantly induced autophagy, whereas co-treatment with lentivirus shRNA-Gadd45b and JNK pathway inhibitors induced autophagy. After 24 hours of OGD/R, the expression of Gadd45b and BDNF was significantly increased after Huwe1 was silenced. CO-IP results showed that Huwe1 interacted with Gadd45b. After CHX treatment, the expression of endogenous Gadd45b was inhibited, while the expression of Gadd45b was increased after CHX and lentivirus shRNA-Huwe1 co-treatment. After treatment, the expression of BDNF and downstream effector molecule was decreased, while the expression of BDNF and downstream effector molecule was increased after treatment with lentivirus shRNA-Huwe1. After silencing Huwe1 expression, the methylation level of the fifth CpG island of BDNF-IXa was decreased, while after silencing Gadd45b expression, the methylation level of the fourth CpG island of BDNF-IXa was increased. Gadd45b regulates apoptosis and autophagy in the pathological process of R. The expression of Gadd45b is regulated by the ubiquitin-proteasome system Huwe1. Gadd45b and Huwe1 mediate the methylation of BDNF IXa.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 赵志青;再灌注心肌损伤的表现及机制(英文)[J];山西医科大学学报;2001年S1期

2 李梦妮,董文斌;丹参在缺血/再灌注损伤中的保护机制[J];中国急救医学;2005年05期

3 Wayne M.Clark,曲东锋,李宏建;卒中的再灌注损伤[J];国外医学(脑血管疾病分册);2005年05期

4 马宇洁,杨兴易;线粒体通透性转换孔与缺血/再灌注损伤[J];中国急救医学;2005年10期

5 陈淼;杨立沛;;他汀预处理对再灌注损伤的研究进展[J];北京医学;2009年04期

6 唐朝枢,苏静怡,张恩潭;休克小肠再灌注损伤的研究Ⅱ.不同再灌注压对再灌注损伤的影响[J];病理生理学报;1985年02期

7 姚睦;荣烨之;温文虎;;再灌注与自由基:再灌注损伤机制的探讨[J];国外医学.心血管疾病分册;1987年02期

8 贾松惠;;再灌注性损伤—偶然中的必然[J];医学与哲学;1992年05期

9 陈在嘉;心肌缺血—再灌注损伤[J];现代诊断与治疗;1993年02期

10 陈长志;王一山;冯卓荣;叶椿秀;朱洪生;;猪心缺血再灌注损伤实验模型的制作和再灌注损伤防治的研究(摘要)[J];医学研究通讯;1993年06期

相关会议论文 前10条

1 周武雄;钟慈声;顾玉东;;血管缺氧再灌注损伤时过氧化氢的分布[A];第九次全国电子显微学会议论文摘要集（Ⅰ）[C];1996年

2 罗翌;唐雪春;;中医药防治脑缺血一再灌注损伤的研究概况及展望[A];2000年全国危重病急救医学学术会议论文集[C];2000年

3 王雯;芦玲巧;蒋东桥;王红霞;范谦;杨新春;刘胜辉;;RISK信号传导通路介导了后处理对再灌注心肌的抗凋亡作用[A];第六届海峡两岸心血管科学研讨会论文摘要集[C];2007年

4 吴仪;李丹宇;粱振家;张树义;刘青斐;姜金卫;谢仲光;黄克显;黄耀宣;邬光惠;路怀霞;;心肌缺血／再灌注和抗自由基治疗的研究(山莨菪碱应用的初步报告)[A];第三次全国急诊医学学术会议论文摘要汇编[C];1990年

5 苗雄鹰;齐海智;赵华;胡辅珍;黄江生;冯大作;姜晓华;钟德午;;丹参在肝移植时对防治肝脏再灌注损伤的作用[A];第七届全国中西医结合普通外科临床及基础研究学术会议论文汇编[C];2001年

6 陈琳;魏欣冰;张岫美;;肾上腺髓质素对原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞缺糖缺氧再灌注损伤的保护作用[A];中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集[C];2007年

7 史载祥;;后再灌注时代难题的中西医结合治疗思考[A];全国中西医结合治疗心血管病及血瘀证高级论坛和研修班论文汇编[C];2004年

8 刘剑刚;张蕾;karoline Peter;张大武;史大卓;Ma yan;;西洋参化学分析及协同后适应对大鼠缺血/再灌注损伤的影响[A];中国心脏大会（CHC）2011暨北京国际心血管病论坛论文集[C];2011年

9 史载祥;;后再灌注时代难题的中西医结合治疗思考[A];第七次全国中西医结合心血管病学术会议论文汇编[C];2005年

10 何蓉;姚德厚;董玲;高峰;王春梅;李源;;GIK对缺血/再灌注犬心肌超微结构的影响[A];全国第十二届心脏学会第十五届心功能学会和《心脏杂志》编委会联合学术会议论文集[C];2011年

相关重要报纸文章 前8条

1 范维琥;中药对心梗患者再灌注损伤有改善作用[N];中国中医药报;2007年

2 胥晓琦 本报记者;风光重现于“后再灌注时代”[N];中国中医药报;2005年

3 万同己;缺血再灌注损伤的药物干预[N];中国医药报;2004年

4 李振彬；李佃贵；李俊侠;清心饮抗心肌缺血/再灌注损伤[N];中国医药报;2005年

5 段晓宏;“一氧化氮及其活性氮介质在缺血/再灌注心肌损伤中的作用及机制研究”获奖[N];中国医药报;2005年

6 ;脊髓再灌注损伤后细胞间黏附分子－1和白细胞介素－1β的表达[N];中国医药报;2003年

7 高春锦;高压氧医学有待进一步挖掘[N];中国医药报;2008年

8 张中桥;皮瓣为何易坏死[N];健康报;2007年

相关博士学位论文 前10条

1 芮涛;小鼠糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的机制研究及白介素-33的作用[D];武汉大学;2014年

2 何清;心肌缺血/再灌注损伤中核受体LXR的保护作用及机制研究[D];上海交通大学;2013年

3 邢坤;山莨菪碱对急性心肌梗死缺血/再灌注损伤的防治效应及其对心肌细胞凋亡影响的机制研究[D];河北医科大学;2015年

4 薛强;线粒体功能蛋白Tom70/MICU1在心肌缺血/再灌注中的作用及机制研究[D];第四军医大学;2015年

5 夏跃胜;容积敏感性氯通道通过自噬调节心肌缺血/再灌注损伤的作用及机制[D];第四军医大学;2016年

6 王国臣;吗啡对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D];河北医科大学;2016年

7 左雅蓓;阿托伐他汀预处理对大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的研究[D];河北医科大学;2016年

8 张猛;大豆低聚糖对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心脏保护作用及相关机制[D];青岛大学;2016年

9 陈远翔;光声成像技术评估心肌缺血和再灌注的活体研究[D];福建医科大学;2015年

10 何国倩;Gadd45b在缺血性脑卒中和卒中后脑可塑性中的作用[D];重庆医科大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 王洁;肠道缺血再灌注致远隔组织损伤时TLR4与HMGB1及下游信号途径的研究[D];北京协和医学院;2015年

2 李王芳;锌离子在内质网应激抑制剂诱导心肌保护中的作用[D];河北联合大学;2014年

3 谢明明;瑞芬太尼对大鼠肾脏缺血再灌注损伤PI3K/Akt信号通路的影响[D];河北医科大学;2015年

4 闫佳佳;太白id木皂苷及其活性单体对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制研究[D];第四军医大学;2015年

5 付志诚;内质网应激在去天门冬氨酸血管紧张素Ⅰ减轻心肌微血管内皮细胞缺血/再灌注损伤中的作用[D];第四军医大学;2015年

6 王琛;EPO衍生肽HBSP抑制大鼠心肌微血管内皮细胞缺血/再灌注损伤的作用研究[D];第四军医大学;2015年

7 闵昱源;梓醇对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D];第四军医大学;2015年

8 龙小菊;参附预处理联合控制性低中心静脉压对肝脏缺血—再灌注损伤的影响[D];南昌大学医学院;2015年

9 赵晓楠;无创性延迟肢体缺血预适应对抗大鼠脑缺血再灌注损伤的线粒体相关机制研究[D];天津医科大学;2015年

10 刘艳;DMOG稳定缺血/再灌注心肌组织HIF-1α表达的时间规律及对线粒体功能的影响[D];山西医科大学;2016年

，

本文编号：2193015