尿激酶与阿替普酶在大鼠脑出血后血肿纤溶治疗中的作用及机制研究

发布时间：2018-08-29 15:46

【摘要】：脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)病死率致残率高,是最具破坏的卒中类型。据一项2017年发表的全国性调查统计显示,我国每年卒中的年龄标准化发病率为246.8/10万人,其中ICH占了23.8%,远高于大多数西方国家。然而,ICH的致伤机制尚未完全明确,ICH后血肿的物理压迫及继发的血肿旁水肿(perihematomal edema,PHE)形成,均可影响患者预后。因此,及时清除血肿,以减轻原发和继发损伤,在ICH治疗中显得尤为重要。然而,受血肿部位及手术本身创伤所限,开颅血肿清除术并不总适用。与传统手术相比,微创手术联合血肿腔内纤溶药物注射治疗对正常脑组织创伤小,疗效好,适用更广,近年来得到关注并逐步发展起来,成为ICH较有前景的治疗措施。目前,该措施中最广泛使用的纤溶药物是阿替普酶,即组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,tPA)。tPA可有效溶解血肿,在ICH后血肿纤溶治疗中疗效受到多项临床试验的认可。然而,有动物实验发现,tPA在辅助清除血肿的同时,存在促进水肿形成、增加炎症反应、促进神经毒性等副作用。这些报道使tPA在颅内纤溶治疗的应用受到了质疑。尿激酶(urokinase-type plasminogen activator,uPA),作为一个纤溶老药(1999年后因停产退出美国市场),在我国广泛应用于ICH后血肿纤溶治疗。在部分幕上脑出血,微创手术联合血肿腔内uPA注射治疗已达成专家共识,为A级推荐。然而,由于对于uPA和tPA这两种纤溶药物在ICH后血肿纤溶治疗应用上缺少临床前或临床研究,药物的选择仍凭借经验。为了探索uPA与tPA在大鼠脑出血后血肿纤溶治疗中的作用及机制,本研究采用大鼠自体血注射诱导脑出血模型,从两部分进行研究:第一部分观察uPA和tPA在大鼠ICH后血肿纤溶治疗的作用,包括纤溶疗效及对PHE的影响;第二部分则通过检测血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)相关指标,对药物于BBB的效应及机制进行研究。一、尿激酶与阿替普酶在大鼠脑出血后血肿纤溶治疗中的作用目的以大鼠ICH模型为基础,分别给予uPA和tPA血肿腔内注射处理,3天后检测血肿体积、PHE范围、脑水含量(brain water content,BWC)、BBB通透性及动物行为学,观察uPA和tPA在ICH后血肿纤溶治疗的疗效。方法实验动物随机分为5组,即sham组、ICH组、ICH+saline组、ICH+tPA组和ICH+uPA组,每组14只。术后30分钟,ICH+saline组、ICH+tPA组和ICH+uPA组分别于血肿中心给予2μl体积的saline、tPA(10μg/μl)、uPA(100 IU/μl),sham组为空白对照组,只进针不注血,ICH组只注血不给药。术后第三天,实验动物进行转角实验和前肢放置实验以做行为学评分,后行磁共振扫描以测算血肿体积及PHE范围。扫描完成后,每组中8只测量BWC以评估水肿程度,剩余6只行伊文斯蓝(evans blue,EB)渗出实验以检测BBB通透性。结果1.磁共振图像分析发现,uPA与tPA血肿腔内注射均可有效缩小血肿体积和PHE范围,且uPA减少PHE范围的作用更加显著(uPA vs tPA,p0.05)。此外,BWC的测量结果显示,uPA可减轻患侧半球水含量,而tPA组与对照组间无统计学差异。2.转角实验和前肢放置试验结果显示uPA可显著改善大鼠ICH后神经功能,而tPA对于神经功能改善未达统计学差异(p0.05)。3.uPA与tPA均有效减小了EB染料血管外渗出,提示两种纤溶药物在稳定ICH后BBB通透性上具有积极作用。结论大鼠ICH后血肿腔内uPA或tPA注射均可缩小血肿体积及PHE范围,对于减少出血后BBB损伤具有一定积极作用。二、尿激酶与阿替普酶对脑出血后血脑屏障的效应及机制研究目的建立大鼠ICH模型,观察给药后,BBB相关紧密连接蛋白(claudin-5、ZO-1)及细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表达情况,探讨uPA与tPA对BBB的保护作用及机制。方法实验动物随机分3组,即ICH+saline组、ICH+tPA组和ICH+uPA组,每组18只。分别于术后30分钟于血肿中心给予2μl体积的saline、tPA(10μg/μl)、uPA(100IU/μl)。术后第三天,实验动物(5/组)通过免疫荧光染色检测BBB相关紧密蛋白(ZO-1,Claudin-5)的表达,另外,ZO-1还采用蛋白质印迹(western blot,WB)法(4/组)进行定量比较;采用WB及实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测MMPs(4/组)的表达;采用WB(5/组)检测平p65与磷酸化p65(p-p65)水平,通过p-p65/p-65间接反映NF-κB通路活性。结果1.通过对血肿周围ZO-1表达检测(免疫荧光,WB)和血肿周围及水肿区皮质的claudin-5免疫染色,发现uPA与tPA均可上调这两种BBB相关紧密连接蛋白表达,提示两种药物对维持BBB完整性有积极作用。2.RT-PCR及WB结果显示,给药组有效降低了大鼠ICH后MMP-12表达,此外,uPA还降低了MMP-2的表达,而tPA对于MMP-2的影响并不显著。对于MMP-9,给药均上调了其表达,而tPA的上调作用更加明显。3.通过WB结果计算p-p65/p65比值,间接反映NF-κB通路激活程度,发现tPA治疗使NF-κB通路激活明显增加,而uPA对此无显著影响。结论尽管大鼠ICH后血肿腔内uPA和tPA注射对NF-κB通路激活作用不同导致MMPs表达存在差异,整体效应上,两种药物均对维持BBB完整性具有一定保护作用。
[Abstract]:Intracerebral hemorrhage (ICH) has the highest mortality and disability rate, and is the most destructive type of stroke. According to a national survey published in 2017, the age-standardized incidence of stroke in China is 246.8/100,000 per year, of which 23.8% is ICH, much higher than in most Western countries. However, the injury mechanism of ICH is not yet complete. Clearly, physical compression of hematoma after ICH and formation of secondary perihematomal edema (PHE) can affect the prognosis of patients. Therefore, timely removal of hematoma to reduce primary and secondary injuries is particularly important in ICH treatment. However, craniotomy is not always suitable for patients limited by the site of hematoma and surgical trauma. Compared with traditional surgery, minimally invasive surgery combined with intracavitary injection of fibrinolytic drugs for hematoma has less trauma to normal brain tissue, better curative effect and wider application. In recent years, it has attracted more and more attention and gradually developed into a promising treatment for ICH. TPA can effectively dissolve hematoma. The efficacy of tPA in fibrinolytic therapy of hematoma after ICH has been approved by many clinical trials. However, animal experiments have found that tPA can promote edema formation, increase inflammation and promote neurotoxicity while assisting in the removal of hematoma. The application of intracranial fibrinolytic therapy has been questioned. Urokinase (uPA), as an old fibrinolytic drug, has been widely used in China as fibrinolytic therapy for post-ICH hematoma. However, due to the lack of preclinical or clinical studies on the use of uPA and tPA in fibrinolytic therapy of hematoma after ICH, the choice of drugs still depends on experience. In order to explore the role and mechanism of uPA and tPA in fibrinolytic therapy of hematoma after intracerebral hemorrhage in rats, we used autologous blood injection to induce cerebral hemorrhage model. The first part is to observe the effect of uPA and tPA on the fibrinolytic therapy of hematoma after ICH in rats, including the effect of fibrinolysis and the effect on PHE. The second part is to study the effect and mechanism of uPA and tPA on BBB by detecting the related indexes of blood-brain barrier (BBB). Objective To observe the therapeutic effect of uPA and tPA on hematoma after ICH by intracavitary injection of uPA and tPA. The hematoma volume, PHE range, brain water content (BWC), BBB permeability and animal behavior were measured after 3 days. The patients were divided into 5 groups: sham group, ICH group, ICH + saline group, ICH + tPA group and ICH + uPA group, with 14 rats in each group. 30 minutes after operation, ICH + saline group, ICH + tPA group and ICH + uPA group were given saline, tPA (10 UG / ml), uPA (100 IU / ml), sham group was blank control group, and ICH + tPA group was given only blood injection without administration. After the scan, 8 rats in each group were measured for BWC to evaluate the degree of edema, and the remaining 6 rats were performed Evans blue (EB) exudation test to detect the permeability of BBB. Results 1. Magnetic resonance imaging analysis showed that U. Both intracavitary injection of PA and tPA could effectively reduce the volume and PHE range of hematoma, and uPA could reduce the PHE range more significantly (uPA vs tPA, p0.05). In addition, BWC measurements showed that uPA could reduce the hemispheric water content of the affected side, while there was no significant difference between tPA group and control group. 2. Angle rotation test and forelimb placement test showed that uPA could significantly reduce the PHE range. Conclusion Both uPA and tPA can reduce the volume of hematoma and the range of PHE after ICH in rats. Objective To establish a rat ICH model and observe the expression of BBB-related tight junction protein (claudin-5, ZO-1) and matrix metalloproteinases (MMPs) after administration. Methods The experimental animals were randomly divided into three groups: ICH+saline group, ICH+tPA group and ICH+uPA group, 18 rats in each group. At 30 minutes after operation, saline, tPA (10 ug/ml) and uPA (100 IU/ml) of 2 UG volume were given to the hematoma center. On the third day after operation, BBB correlation was detected by immunofluorescence staining in the experimental animals (5/group). The expression of compact protein (ZO-1, Claudin-5) was compared quantitatively by Western blot (WB), real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), and the levels of pingp65 and phosphorylated p65 (p-p65) were detected by WB (5/group), respectively. Results 1. By detecting the expression of ZO-1 around hematoma (immunofluorescence, WB) and claudin-5 immunostaining around hematoma and edema area cortex, it was found that uPA and tPA could up-regulate the expression of these two BBB-related tight junction proteins, suggesting that the two drugs have a positive effect on maintaining the integrity of BBB. 2. RT-PCR and WB results were obvious. In addition, uPA also decreased the expression of MMP-2, but the effect of tPA on the expression of MMP-2 was not significant. For MMP-9, the administration of tPA increased the expression of MMP-2, and the up-regulation effect of tPA was more obvious. 3. The ratio of p-p65/p65 calculated by WB results indirectly reflected the activation of NF-kappa B pathway. It was found that tPA treatment made the activation of NF-kappa B pathway. Conclusion Although the activation of NF-kappa B pathway is different between uPA and tPA injection in ICH rats, the expression of MMPs is different. On the whole effect, both drugs have a certain protective effect on the integrity of BBB.
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.34

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本文编号：2211662