黄芩苷激活MRTF-A介导的抗缺血性脑神经细胞凋亡作用及机制研究

发布时间：2018-10-10 13:53

【摘要】：目的：在整体及细胞水平研究黄芩苷对缺血性脑神经元损伤的保护作用，并探讨其激活MRTF-A介导的抗过氧化氢诱导的皮层神经元凋亡的机制。方法： 1.黄芩苷对右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）/再灌注损伤大鼠脑神经功能、脑梗塞体积的影响：36只雄性成年SD大鼠（250-300g）随机分成6组：黄芩苷低中高剂量组（50，100和200mg/kg，腹腔注射）、尼莫地平组（阳性对组，0.4mg/kg，腹腔注射）、模型组（等量生理盐水、腹腔注射）及正常对照组（等量生理盐水、腹腔注射）。在行MCAO手术前，按分组要求分别腹腔注射黄芩苷及生理盐水，连续给药3天。3天后，对模型组、黄芩苷高中低剂量组及尼莫地平组大鼠进行MCAO手术。2小时后，抽出尼龙丝进行24小时再灌注。用Longa法对大鼠进行神经功能缺损评分；取脑组织，用TTC染色评价脑梗塞体积损伤程度；采用Western blot和RT-PCR检测脑组织中BCL-2及MCL-1表达水平；采用免疫荧光法检测脑组织中MRTF-A的表达。 2.黄芩苷激活MRTF-A介导抗过氧化氢（H2O2）诱导神经元凋亡作用及机制：转染MRTF-AsiRNA至体外培养大鼠原代皮层神经元，48小时后，用黄芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干预神经元。24小时后，用H2O2（800μM）处理细胞30min。采用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，用Western blot和RT-PCR检测BCL-2及MCL-1表达水平，以此在细胞水平证明黄芩苷抗H2O2诱导神经元凋亡作用是通过MRTF-A激活BCL-2及MCL-1的表达实现的；在此基础上，构建启动子含CArG box的BCL-2-luc及MCL-1-luc及其突变体mut BCL-2-luc及mut MCL-1-luc报告基因质粒，并转染至体外培养大鼠原代皮层神经元中，48小时后，用黄芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干预神经元。同样用H2O2（800μM）处理细胞30min。采用荧光素酶检测法检测其活性，以此证明黄芩苷介导MRTF-A的转录激活作用与MRTF-A作用于BCL-2及MCL-1启动子上的CArG box有关。 3.黄芩苷激活MRTF-A介导的抗H2O2诱导神经元凋亡作用及对BCL-2及MCL-1基因的转录激活作用可能与其激活PI3K、ERK1/2信号通路有关：体外培养大鼠原代皮层神经元，转染BCL-2-luc及MCL-1-luc及其突变体报告基因质粒至皮层神经元中，48小时后，用PI3K抑制剂（LY29004）和ERK1/2（PD98059）处理细胞。12小时后，用黄芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干预细胞。24小时后，用H2O2（800μM）处理细胞30min。采用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率；Western blot检测MRTF-A表达水平；采用荧光素酶检测法检测BCL-2-及MCL-1-luc活性。结果： 1.在整体水平证明了黄芩苷能减少MCAO/再灌注引起的大鼠脑组织损伤：大鼠脑MCAO2h再灌注24h后，TTC染色显示黄芩苷（100和200mg/kg）处理组大鼠脑梗死区体积分别为20.71±9.79和11.55±5.09mm3，模型组脑梗死区体积为39.34±7.32mm3，与模型组比较，黄芩苷组脑梗死区体积明显减小（p0.05或p0.01）；Longa法神经功能缺损评分显示：黄芩苷（100和200mg/kg）处理组评分明显低于模型组（p0.05或p0.01）；Western blot和RT-PCR检测结果表明，与模型组相比较，黄芩苷（100和200mg/kg）处理组大鼠脑组织的BCL-2及MCL-1表达水平显著高于模型组（p0.05或p0.01）；激光共聚焦检测发现黄芩苷处理组（100和200mg/kg）大鼠缺血侧脑组织的凋亡细胞明数明显少于模型组；免疫荧光观察发现在黄芩苷处理组（100和200mg/kg）的大鼠脑组织中MRTF-A的表达明显高于模型组，且显示黄芩苷可能促进了MRTF-A从胞浆向细胞核的转移。 2.在细胞水平证明了黄芩苷抗H2O2诱导神经元凋亡作用是通过MRTF-A激活BCL-2及MCL-1的转录表达实现的：黄芩苷（0.7μM、1.4μM、2.8μM）干预神经元24h，H2O2（800μM）处理细胞30min，FCM结果显示模型组神经细胞凋亡率显著高于空白对照组，黄芩苷（1.4μM、2.8μM）干预组的凋亡率明显下降（p0.05或p0.01），而MRTF-A siRNA组则没有观察到此变化；Western blot和RT-PCR显示BCL-2及MCL-1表达随黄芩苷浓度（1.4μM、2.8μM）增加而增加（p0.05或p0.01），而MRTF-A siRNA组则没有观察到此变化；荧光素酶检测法检测到BCL-2-及MCL-1-luc活性随黄芩苷浓度增加而增强（p0.05或p0.01），而MRTF-A siRNA组则没有观察到此变化。 3.在细胞水平证明了黄芩苷激活MRTF-A介导的抗H2O2诱导神经元凋亡作用及对BCL-2及MCL-1基因的转录激活作用可能与其激活PI3K、ERK1/2信号通路有关：FCM结果显示模型组神经细胞凋亡率显著高于空白对照组（p0.01）；黄芩苷（1.4μM、2.8μM）干预组的凋亡率分别为28.0%±2.10和14.1%±1.50，明显低于模型组（p0.01）；用PI3K抑制剂（LY29004）或ERK1/2（PD98059）干预后，其凋亡率分别为38.4%±4.33、36.6%±4.10和29.7%±3.95，与对应的黄芩苷组比较，其凋亡率明显升高，与黄芩苷中高剂量对应组间比较，具有统计学差异（p0.05或p0.01）；Western blot显示：MRTF-A表达随黄芩苷浓度增加而增加，与模型组比较具有显著性差异（p0.05或p0.01），而用PI3K抑制剂（LY29004）或ERK1/2（PD98059）干预后，MRTF-A表达又下降，与黄芩苷中高剂量对应组间比较，，具有统计学差异（p0.05）；荧光素酶检测法检测到BCL-2-及MCL-1启动子转录活性发现，PI3K抑制剂（LY29004）或ERK1/2（PD98059）能够逆转黄芩苷对BCL-2-及MCL-1启动子转录活性的影响，与其对应剂量组间比较具有统计学差异（p0.05或p0.01）。结论： 1.在整体动物水平，证明了黄芩苷可以明显改善MCAO/再灌注诱导的神经功能损伤，减少脑梗塞体积，且能增强缺血侧脑组织中MRTF-A的表达及核转移。 2.在细胞水平，证明了黄芩苷抗H2O2诱导皮层神经元凋亡作用是与其激活MRTF-A表达有关；黄芩苷能通过激活内源性MRTF-A表达上调皮层神经元中抗凋亡基因BCL-2及MCL-1的转录表达，且该作用与MRTF-A激活BCL-2及MCL-1启动子CArG盒的转录活性有关。 3.在细胞水平，证明了黄芩苷抑制H2O2诱导的皮层神经元凋亡及激活MRTF-A介导BCL-2和MCL-1表达的上调可能与PI3K和ERK1/2信号通路相关。
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【学位授予单位】：武汉科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741

【参考文献】