淫羊藿苷干预EAE发病的雌激素样作用的机制研究

发布时间：2018-10-16 21:50

【摘要】：背景：多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种缓慢进展的中枢神经脱髓鞘疾病，其特点是大脑与脊髓内播散性脱髓鞘，造成时间、空间多发的症状、体征，且病程常有多次的缓解与复发[1]。大剂量糖皮质激素（glucocorticoid,GC）冲击治疗可以缓解本病，但不能根治，且长期使用糖皮质激素有引起高血压、糖尿病、骨质疏松等严重副作用。国内外研究证实MS多发于女性，且病程的缓解复发与雌激素水平密切相关，补充雌激素可以减少病情的复发[2]。但长期大量使用雌激素存在引发生殖系统肿瘤、脑血栓疾病的风险。因此，本研究选用具有雌激素样作用的淫羊藿苷（icraiin,ICA）作为治疗药物，通过对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）模型神经损害、病理、激素水平、相关受体蛋白及mRNA的表达，探讨ICA的疗效、剂量相关性及其与雌激素作用途径的关系。目的：构建MS的动物模型--EAE小鼠模型，用雌激素、雌激素拮抗剂及不同剂量的ICA治疗EAE小鼠，从临床症状评分、细胞因子水平、组织病理学改变等方面探讨ICA对EAE的治疗作用；从分子水平、雌激素受体蛋白及mRNA表达水平等方面分析不同剂量ICA对雌激素受体蛋白及mRNA的影响，在前期研究的基础上进一步研究ICA的治疗作用与雌激素样作用的相关性。方法： 1、用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline,PBS）将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55）稀释成600ug/ml,将MOG35-55稀释液与等体积的完全佛氏佐剂（complete freud’s adjuvant,CFA）(灭活的结核分枝杆菌的终浓度为5mg/ml)混合作为抗原乳剂，接种在C57BL/6小鼠脊柱两侧皮下四个部位，每个部位接种50ul，在免疫后第0及48小时腹腔内分别注射500ng百日咳毒素，免疫后第7天加强免疫一次，抗原剂量与第一次相同，诱导MS的小鼠EAE模型。 2、将EAE模型小鼠按神经功能评分随机分成7组，每组6只。分别为；A为雌激素组，给予己烯雌酚0.2mg/kg.d灌胃；B为大剂量ICA组，给予ICA300mg/kg.d灌胃；C为中剂量ICA组，给予ICA150mg/kg.d灌胃；D为小剂量ICA组，给予ICA50mg/kg.d灌胃；E为雌激素拮抗剂ICI182,780组，给予ICA150mg/kg.d灌胃加ICI182,7801mg/mouse.d皮下注射；M为模型对照组，给予等容量0.5%羧甲基纤维素钠灌胃；N为正常对照组，给予等容量0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。小鼠免疫接种后第9天开始陆续发病，第14天左右达到发病高峰期，在免疫第9天每天观察小鼠神经功能评分及体重，按评分情况将小鼠分在各组。在免疫第14天开始连续给药，5天后将各组小鼠处死取材，取血及脑、脊髓等组织。 3、取小鼠脊髓腰膨大处进行HE染色，观察小鼠脱髓鞘情况；将脑组织进行匀浆，提取RNA，用PCR法检测脑组织中雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）及雌激素受体β(estrogen receptorβ, ERβ)mRNA的含量；将脑组织进行匀浆，提取蛋白质，用Western-blot法检测脑组织中ERα和ERβ蛋白的含量。 4、用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的含量。并用放射免疫法检测血清中雌二醇的含量（estradiol）。 5、对药物治疗各组小鼠进行临床症状评分、体重称量,对细胞因子含量、雌激素含量、ER mRNA表达量等进行综合分析，研究ICA的雌激素样作用及对EAE小鼠的治疗作用。结果： 1、利用MOG35-55乳剂成功建立了EAE小鼠模型，C57BL/6小鼠于免疫后第9天开始发病，最高神经功能评分达5分，发病期脊髓病理切片示，，脊髓实质内大量淋巴细胞浸润，血管周围最多，呈“袖套样”改变。正常对照小鼠未见明显病理改变。 2、雌激素组（A组）、大剂量ICA组（B组）、中剂量ICA组（C组），治疗后体重有所增加，但无统计学意义。小剂量ICA组（D组）体重减轻，差异没有统计学意义，P＞0.05；中剂量ICA+ICI组（E组）治疗后体重减轻，P＞0.05；治疗后临床评分C、D、E各组都有所下降，以C组和D组下降最明显，F组评分均值保持不变，F组和D组评分比较差异明显，P＜0.05。模型对照组（M组）症状评分升高。 3、内源性雌激素水平：和模型对照组比较及ICI组比较，大剂量组ICA组升高明显，P＜0.05，具有统计学意义；中剂量组、小剂量组变化有升高，但没有统计学意义，P＞0.05；模型对照组与ICI组比较，无明显差异，而雌激素组有下降。 4、脑组织中ER mRNA表达水平：①ERa：与M(模型对照组)比较，A（雌激素组）和B（大剂量组）明显升高（P＜0.05），C（中剂量）、D（小剂量组）稍有升高；M（模型对照组）与E组（ICI+中剂量组）无明显差异。②ERβ：与ICI组及模型组比较，A（雌激素组）及B（大剂量组）升高明显（P＜0.05），C（中剂量）和D（小剂量组）稍有升高（P＞0.05）， B（模型对照组）与E组（ICI）无明显差异。 5、脑组织中ER蛋白含量：①ERa：与M(模型对照组)比较，A（雌激素组）和B（大剂量组）明显升高（P＜0.05），C（中剂量）、D（小剂量组）稍有升高；M（模型对照组）与E组（ICI+中剂量组）无明显差异。②ERβ：与ICI组及模型组比较，A（雌激素组）及B（大剂量组）升高明显（P＜0.05），C（中剂量）和D（小剂量组）稍有升高（P＞0.05）， B（模型对照组）与E组（ICI）无明显差异。 6、TGF-β水平：各组模型鼠血清中TGFβ水平均较正常组低。其中A（雌激素组）及B(大剂量ICA组)与M(模型对照鼠)及ICI组比较，TGFβ水平增高明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）；C(中剂量ICA组)、D(小剂量ICA组)与M(模型对照组)比较，TGFβ水平有所增高，但差异无统计学意义，ICI组与模型组无明显差异。结论： 1、ICA对EAE的临床症状、神经病理、炎性反应具有治疗作用。 2、ICA通过促进小鼠内源性雌激素及ER增加，与脑中含量更高的ERβ结合，对EAE的治疗具有针对性，具有雌激素样作用。 3、ICI182,780作为雌激素拮抗剂，ICI对雌激素有拮抗作用，ICI组治疗作用减低，表明ICA系通过ER而发挥治疗EAE的作用。
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【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R744.51

【参考文献】