细菌感染诱导神经炎症中星形胶质细胞活化及死亡的分子机制研究

发布时间：2018-10-18 08:16

【摘要】：【目的】中枢神经系统感染性疾病表现为脑或脊髓遭受细菌入侵而产生的一系列临床症状,是神经科常见的疾病之一。其中细菌性脑膜炎(bacterial meningitis,BM)发病迅速,需要及时明确诊断实施有效的抗生素治疗,然而在临床实践中,BM的诊断金标准脑脊液细菌培养阳性率低、耗费时间长,难以满足临床需要。不仅如此,BM患者往往罹患认知记忆功能损害、听力下降等后遗症,临床尚无有效治疗方法,给患者及社会带来巨大负担,因此,早期明确诊断及控制晚期后遗症是神经科医生迫切需要解决的两大难题。降钙素原(Procalcitonin,PCT)是细菌感染特异性诱导因子,组织细胞如脂肪细胞等受到细菌及细菌成分如内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激时均可表达释放PCT入血,因此血清PCT是外周细菌感染、脓毒血症等良好诊断标志物。然而脑内细胞受到细菌及LPS刺激后是否也存在类似PCT的表达及分泌却尚不明确。已知脑内星形胶质细胞与小胶质细胞在细菌及LPS刺激下明显活化增生,伴有炎性因子等多种蛋白表达增多,因此,我们拟首先探讨脑内细胞在细菌及LPS刺激下PCT表达与分泌情况,为PCT作为脑内细菌感染诊断标志物提供理论基础。既往已有大量文献证实BM患者后遗症的发生与脑内胶质细胞所介导的神经炎症网络过度放大有关。作为脑内含量最丰富的胶质细胞,在细菌感染过程中,星形胶质细胞迅速增殖活化,对于放大神经炎症网络发挥了最为关键的作用。因此,通过凋亡或生长周期阻滞减少过度活化的星形胶质细胞数目是调控神经炎症网络的有效方法。在肿瘤领域研究中发现,生长阻滞特异性蛋白1(Growth arrest specific 1,Gas1)可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,近期有研究证明脑内星形胶质细胞表达Gas1,但功能尚不明确,那么,Gas1是否参与了星形胶质细胞的命运调控?我们进一步探索Gas1在活化星形胶质细胞命运的调控作用以及可能的信号通路。本研究借助细菌感染过程中重要的致炎成分LPS建立神经炎症模型,研究星形胶质细胞的活化、PCT的表达分泌,及活化星形胶质细胞的命运问题。【方法】首先建立肺炎链球菌及LPS脑内注射神经炎症模型,通过免疫荧光双标记染色、western blot及Elisa观察脑内PCT的时空表达特点及脑脊液血清PCT含量变化,体外判断星形胶质细胞PCT的表达及分泌。然后观察LPS脑内注射神经炎症模型活化星形胶质细胞Gas1的表达及细胞凋亡情况,体外通过LPS及炎性因子刺激原代培养的星形胶质细胞,利用Brdu掺入实验、流式细胞术、CCK8、LDH释放实验、ROS检测、Tunel等方法观察细胞周期、细胞活力、凋亡等变化及与Gas1表达的关系,进一步设计针对Gas1的si RNA序列干扰活化星形胶质细胞Gas1的表达,判断Gas1对活化星形胶质细胞凋亡及细胞周期的影响,通过western blot方法分析Gas1胞内信号通路。【结果】1.肺炎链球菌及LPS脑内注射神经炎症模型海马星形胶质细胞明显活化,伴有PCT表达显著升高,CSF PCT含量升高,同时海马神经元及CSF中渗入的中性粒细胞阳性表达PCT。2.人脑海马星形胶质细胞及神经元存在PCT阳性表达。3.LPS脑内注射诱导活化星形胶质细胞凋亡数目明显增多,伴有Gas1表达升高。4.体外单纯LPS刺激对星形胶质细胞活力无明显作用,LPS+IFNγ+TNFα联合刺激星形胶质细胞,细胞氧化应激水平明显升高,细胞凋亡增多,细胞生长周期阻滞,伴有Gas1表达升高。5.si RNA敲低活化星形胶质细胞Gas1表达水平,导致LPS+IFNγ+TNFα联合刺激下星形胶质细胞凋亡减少,但是细胞周期阻滞无明显改善。6.Gas1通过增高活化星形胶质细胞内Bax/Bcl2比例,激活caspase-3的表达促进活化星形胶质细胞的凋亡,对炎性信号通路、细胞增殖蛋白表达无明显作用。【结论】1.证明了大鼠及人脑内星形胶质细胞PCT的表达,在LPS及肺炎链球菌刺激下活化星形胶质细胞表达PCT明显增多,CSF PCT含量升高,提示PCT可能是脑内细菌感染诊断标志物(Figure 1)。2.发现LPS诱导神经炎症中活化星形胶质细胞凋亡增多,细胞周期阻滞,伴有Gas1表达升高,说明了活化星形胶质细胞通过凋亡及细胞增殖阻滞的方式减少细胞数目。3.明确了Gas1在活化星形胶质细胞凋亡中的作用,干扰Gas1的表达可以导致活化星形胶质细胞凋亡减少,但是细胞周期阻滞无明显改善,提示Gas1可以作为调控活化星形胶质细胞凋亡,进而改变神经炎症网络程度,减少BM患者认知功能损害等后遗症的潜在靶点。4.阐明了Gas1促使活化星形胶质细胞凋亡的分子机制,即通过增高Bax/Bcl2的比例,激活caspase-3的表达诱导星形胶质细胞的凋亡(Figure 1)。Figure 1细菌感染诱导神经炎症中星形胶质细胞活化与死亡的模式图。细菌/细菌成分LPS诱导星形胶质细胞活化,释放PCT增多,CSF PCT含量升高,是脑内细菌感染潜在诊断标志物。活化星形胶质细胞Gas1表达升高,上调Bax/Bcl2,激活caspase-3,诱导活化星形胶质细胞凋亡增多。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R741
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本文编号：2278535