褪黑素调节的自噬在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的作用及机制研究

发布时间：2018-10-26 08:22

【摘要】：研究背景蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是临床上常见的神经外科急症,占所有中风的5%-10%左右。自发性蛛网膜下腔出血的最主要病因是颅内动脉瘤破裂(约占80%),随着技术的发展和临床经验的积累,早期夹闭或栓塞动脉瘤避免了动脉瘤再次出血,可明显降低其死亡率。但是,夹闭或栓塞动脉瘤并不能终止蛛网膜下腔出血的病理生理学过程,蛛网膜下腔出血后的脑损伤仍然存在或继续进展,最终导致不良预后。在过去,脑血管痉挛一直被认为是导致高死亡率和高致残率的主要因素,然而,针对脑血管痉挛的治疗在临床上并未获得成功。早期脑损伤(early brain injury, EBI)是指从蛛网膜下腔出血开始至72小时这一时间窗之内的脑损伤。早期脑损伤是一个非常复杂的病理生理学过程,可能主要与颅内压升高、脑血流量降低、脑灌注压下降、血脑屏障破坏和脑水肿等有关。大量的动物实验证实：神经炎症和神经系统细胞凋亡是早期脑损伤的两个主要的损伤机制,但具体的发生机制仍需要进一步的研究。自噬是溶酶体对自身结构进行吞噬降解的过程。研究发现自噬广泛存在于正常的生理病理过程中。近年来,自噬与炎症小体的交互作用被广泛研究。目前的研究结果提示,自噬调控炎症小体活性可能的机制是一方面自噬泡通过包裹损伤的线粒体,降低了胞浆中活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的水平,从而影响了NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing3)的激活；另一方面,激活的自噬通过对损伤的线粒体进行有调控地降解和外排,从而降低了损伤的线粒体向胞浆中释放线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA),进而影响了NLRP3炎症小体对含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)1的激活以及下游白细胞介素(interleukin, IL)-1β的成熟和释放。而自噬与凋亡也有着密切的关系,在同一个细胞中,甚至能够同时出现自噬和凋亡的形态学特征。对自噬活性的调节,被证明对防止线粒体功能障碍具有保护作用,并且这一作用与自噬在神经退行性病变中的神经保护作用相关。我们的研究组的前期研究结果表明,自噬的激活能够通过影响细胞凋亡的线粒体途径,对抗细胞的凋亡,进而产生神经保护作用。近年来褪黑素被证明在不同的疾病模型中能够对自噬水平起到调节作用。有研究表明褪黑素促进的自噬在缺血再灌注模型中能起到有效的神经保护作用。但褪黑素在蛛网膜下腔出血模型中对自噬水平的影响以及其对神经炎症和神经系统细胞凋亡的作用依然缺乏深入的研究。本研究将观察自噬在早期脑损伤中对神经炎症的作用并研究其可能的机制,同时探索褪黑素治疗后对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中自噬水平的影响,并进一步研究这些变化对早期脑损伤中神经炎症和神经系统细胞凋亡的影响及其可能的机制。实验方法第一部分 1.采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血模型,成年雄性SD大鼠被随机分为假手术组(Sham组),蛛网膜下腔出血组(SAH组)；SAH组按取材时间不同又分为蛛网膜下腔出血后6h组(SAH6h组)、蛛网膜下腔出血后12h组(SAH12h组)、蛛网膜下腔出血后24h组(SAH24h组)、蛛网膜下腔出血48h组(SAH48h组)和蛛网膜下腔出血后72h组(SAH72h组),通过神经功能缺陷评分,脑水含量测定检测脑损伤程度。采用Western blot检测自噬相关蛋白(Atg5、Beclinl和LC3)和炎症因子(IL-1p)的表达；采用免疫组织化学检测炎症细胞的表达量,并观察自噬相关蛋白是否在小胶质细胞中表达。 2.成年雄性SD大鼠侧脑室注射分别给予自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和自噬的激活剂雷帕霉素(RAP),成年雄性SD大鼠被随机分为假手术+溶剂组、蛛网膜下腔出血+溶剂组、蛛网膜下腔出血+雷帕霉素预处理组和蛛网膜下腔出血+3-MA预处理组,通过神经功能缺陷评分,脑水含量测定检测早期脑损伤程度。采用Western blot检测自噬相关蛋白(Atg5、Beclinl和LC3)、炎症因子(IL-1p)和NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、ASC和Caspasel)的表达。第二部分 1.成年雄性SD大鼠腹腔注射褪黑素(150mg/kg),成年雄性SD大鼠被随机分为假手术+溶剂组、蛛网膜下腔出血+溶剂组和蛛网膜下腔出血+褪黑素治疗组,通过神经功能缺陷评分,不同部位脑组织的脑水含量测定检测早期脑损伤程度。 2.(1)成年雄性SD大鼠被随机分为假手术+溶剂组、蛛网膜下腔出血+溶剂组和蛛网膜下腔出血+褪黑素治疗组,测量脑组织Evans blue含量,免疫组织化学检测脑组织IgG染色,采用Western blot检测紧密连接相关蛋白(ZO-1、occludin和claudin5)、炎症反应相关蛋白(MMP9和VEGF)和炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-a)的表达,明胶酶谱法检测炎症反应相关蛋白(MMP9和MMP2)的活性。 (2)成年雄性SD大鼠侧脑室注射自噬抑制剂3-MA,腹腔注射褪黑素,成年雄性SD大鼠被随机分为假手术+溶剂组、蛛网膜下腔出血+溶剂组、蛛网膜下腔出血+褪黑素治疗组和蛛网膜下腔出血+褪黑素治疗组+3-MA预处理组,采用Western blot检测自噬相关蛋白(Atg5、Beclin1和LC3)、炎症因子(IL-1β)和NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、ASC和caspase1)的表达。 3.(1)成年雄性SD大鼠被随机分为假手术+溶剂组、蛛网膜下腔出血+溶剂组和蛛网膜下腔出血+褪黑素治疗组,通过TUNEL法测定细胞凋亡程度,免疫组织化学检测凋亡相关蛋白(Caspase3)的表达程度。 (2)成年雄性SD大鼠被随机分为假手术+溶剂组、蛛网膜下腔出血+溶剂组、蛛网膜下腔出血+褪黑素治疗组和蛛网膜下腔出血+褪黑素治疗组+3-MA预处理组,Western blot检测自噬相关蛋白(LC3)、凋亡相关蛋白(胞浆Bax、胞浆Cytochrome c、线粒体Bax、线粒体Cytochrome c和Caspase3)的表达。结果第一部分 1.蛛网膜下腔出血后72h内大鼠的脑水含量上升程度和神经功能评分下降程度在24h时达到高峰,western blot结果显示蛛网膜下腔出血后72h内LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ比率上升,Atg5、Beclinl和IL-1p的水平上升,在24小时达到高峰。免疫组织化学结果提示,蛛网膜下腔出血后24h,脑组织ED1阳性标记的炎症细胞数量增加,LC3和小胶质细胞的标志物离子钙接头分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule1, Ibal)共荧光定位,提示LC3在小胶质细胞内表达。 2.蛛网膜下腔出血后24h,Western blot结果显示3-MA预处理降低了LC-3Ⅱ/LC3-I比率,下调了Atg5和Beclinl的水平,IL-1β、NLRP3、ASC和Caspase1的水平上升,并且加剧了脑水含量的上升和神经功能缺陷；Western blot结果显示RAP预处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率上升,Atg5和Beclinl的水平升高,减少了IL-1β、 NLRP3和Caspase1水平的上升,并且缓解了脑水含量的上升和神经功能缺陷。第二部分 1.蛛网膜下腔出血后24h,褪黑素治疗缓解了左右脑半球脑水含量的上升和神经功能缺陷。 2.(1)蛛网膜下腔出血后24h,褪黑素治疗缓解了Evans blue染料和IgG的漏出,Western blot结果显示,褪黑素治疗缓解了ZO-1、occludin和claudin5水平的下降,减轻了MMP9、VEGF、IL-1β、IL-6和TNF-α水平的上升,下调了MMP9的活性上升。 (2)蛛网膜下腔出血后24h, Western blot结果显示褪黑素治疗进一步升高了LC-Ⅱ/LC-Ⅰ的比率,增加了Atg5和Beclin1的水平,下调了IL-1β、NLRP3和Caspase1的水平；3-MA预处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率下降,Atg5和Beclinl的水平下降,IL-1β、NLRP3和Caspase1的水平上升。 3.(1)蛛网膜下腔出血后24h, TUNEL的结果显示褪黑素治疗缓解了细胞凋亡的上升,减轻了Caspase3表达的增加。 (2)蛛网膜下腔出血后24h, Western blot的结果显示褪黑素治疗进一步升高了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率,减轻了Caspase3、细胞胞浆Cytochrome c和线粒体Bax水平的上升；3-MA预处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率下降,Caspase3、细胞胞浆Cytochrome c和线粒体Bax的水平上升。结论第一部分 1.蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中,脑水肿、炎症因子IL-1β和自噬激活水平均在24h达到高峰。结合蛛网膜下腔出血后24h炎症相关细胞的激活水平和自噬相关蛋白在小胶质细胞上的表达,提示自噬的激活可能在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的炎症反应中起重要作用。 2.自噬的诱导剂RAP提高了自噬水平,降低了炎症因子IL-1β的水平,减轻了蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤；相反的,自噬抑制剂3-MA降低了自噬水平,升高了炎症因子IL-1p的水平,加重了蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。自噬对炎症因子IL-1β的这一作用可能与其调控NLRP3炎症小体影响其激活Caspase1有关。第二部分 1.褪黑素在大鼠蛛网膜下腔出血后减轻了双侧大脑半球脑组织水肿,并改善其神经功能。 2.褪黑素治疗在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中降低了IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的水平,调节了VEGF和MMP9的蛋白水平,抑制了MMP9的活性,进而减轻血脑屏障中紧密连接的破坏,维持了血脑屏障的完整性。褪黑素调节IL-1β水平的机制可能是由于上调了蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的自噬水平,降低了炎症小体NLRP3相关蛋白NLRP3的蛋白水平,进而影响了下游炎症因子IL-1β的水平,最终对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的炎症反应产生了调节作用。 3.褪黑素治疗在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中抑制了神经系统细胞凋亡。褪黑素这一作用的机制可能与其在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中能够进一步上调自噬水平,抑制了Bax向线粒体的聚集,从而缓解了细胞色素C向细胞胞浆中的释放,最终下调了凋亡相关蛋白Cleaved caspase3的蛋白水平有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.35

【参考文献】