GLYX-13对脑缺血性神经元损伤保护性机制的研究

发布时间：2018-10-31 12:27

【摘要】：研究目的:谷氨酸和过度激活的NMDA受体结合所介导的兴奋毒损伤作用是脑卒中等脑组织缺血性疾病主要的病理生理机制。在过去的几十年中,NMDA受体阻滞剂被广泛的用于脑卒中、阿尔兹海默症等神经精神性疾病的干预性研究中,然而由于其严重的神经系统副作用,多数NMDA受体阻滞剂在相关临床研究中均以失败告终。近年来相关研究表明在脑卒中发生后的数小时乃至数日内的脑组织中普遍存在神经元受损以及NMDA受体功能减退等表现,鉴于此本研究另辟蹊径试图通过调节NMDA受体活性这一手段抑制兴奋毒损伤作用并提升和改善脑卒中后的NMDA受体功能。本论文中所研究的干预性药物GLYX-13(rapastinel)是一种NMDA受体甘氨酸位点的调节剂,有相关研究表明该药物对神经元具有保护性且毒副作用较小,然而至今国内外尚无GLYX-13改善缺血性神经元损伤作用机制的研究报道。据此,本研究在小鼠在体大脑中动脉阻塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO模型)以及离体脑片氧葡萄糖剥夺模型(Oxygen Glucose Deprivation,OGD模型)的基础上,通过观察GLYX-13对脑组织缺血/缺氧后有无神经保护效应及其对NMDA受体功能和突触可塑性的影响,探讨该药物对缺血性神经元损伤的保护性作用机制及其途径,为临床治疗脑卒中提供创新思路和方法。研究方法:1.探索GLYX-13对在体MCAO模型小鼠的神经保护性作用,研究方法如下:(1)实验动物分组:2月龄体重20-25g雄性C57BL/6小鼠随机分为3组,即假手术组(Sham)、MCAO模型给予生理盐水对照组(Vehicle)、MCAO模型给予GLYX-13干预组(GLYX-13)。(2)MCAO模型小鼠的制备:采用硅胶线栓法阻塞小鼠右侧大脑中动脉供应区血流,线栓阻塞血流时间为60min。(3)MCAO模型脑血流量检测:应用激光多普勒血流检测仪对造模前后小鼠的大脑中动脉中央供应区血流量进行检测,只有造模后脑血流量小于或等于造模前基线水平20%的小鼠方能被纳入后续研究。(4)应用GLYX-13干预:于MCAO术后两小时经腹腔注射给予GLYX-13干预组小鼠10mg/kg的GLYX-13。(5)神经功能学评分:参考Longa神经功能学评分对以上3组小鼠进行神经功能评估。(6)脑组织梗塞范围的检测:应用TTC染色检测3组小鼠的脑组织梗塞范围。(7)脑组织海马神经元损伤程度检测:应用脑组织石蜡切片HE染色以及Fluoro Jade C染色检测3组小鼠海马神经元的损伤。2.探讨GLYX-13对缺血性神经元损伤的保护性作用机制,研究方法如下:(1)脑组织中NMDA受体含量及其磷酸化水平的检测:应用Western blot检测再灌注4h以及24h后3组小鼠脑组织中NR2A、NR2B、p-NR2A(Tyr1325)以及p-NR2B(Tyr1472)的表达。(2)电生理脑片全细胞膜片钳实验(1)实验分组:4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,即对照组(Con)、脑片OGD模型组、脑片OGD同时给予GLYX-13干预组(OGD+GLYX-13)、脑片OGD同时给予GLYX-13和NMDA受体甘氨酸位点全效激动剂D-serine干预组(OGD+GLYX-13+D-serine)。(2)离体脑片OGD模型的制备:用于模拟脑组织缺血后能量供应缺乏这一情况,采用被95%N2+5%CO2的混合气所饱和的人工脑脊液(ACSF)来灌流脑片,并且这种ACSF中的10mmol/L的葡萄糖被同浓度的蔗糖所替代。对脑片施加OGD的持续时间为5min。(3)诱发性的兴奋性突触后电流(EPSC)的检测:电刺激海马脑片shaffer侧枝并应用电生理脑片全细胞膜片钳技术分别记录4组脑片海马CA3-CA1 shaffer collateral通路EPSC、NMDA-EPSC以及NR2A和NR2B亚型所介导的EPSC的幅值。(3)在体MCAO模型脑组织梗塞范围的检测:应用TTC染色检测GLYX-13+D-serine处理组、GLYX-13+NVP-AAM077(特异性NR2A亚型拮抗剂)处理组以及GLYX-13+Ro256981(特异性NR2B亚型拮抗剂)处理组小鼠的脑组织梗塞体积,并将其结果与本研究第二章节中的TTC染色结果进行比较,进一步证实GLYX-13很可能是通过调节NMDA受体NR2亚基组分这一途径从而发挥对病理性突触可塑性的抑制作用以及神经保护作用这一猜想。研究结果:1.GLYX-13对在体MCAO模型小鼠的神经保护性作用(1)GLYX-13改善了小鼠缺血再灌注24h后的神经功能学评分:GLYX-13干预组小鼠的神经功能评分显著低于盐水对照组(n=12,***p0.001)。(2)GLYX-13减少了小鼠脑缺血再灌注24h后的脑梗塞体积:与盐水对照组相比,GLYX-13干预组小鼠的脑梗塞体积显著减少(n=12,###p0.001)。(3)GLYX-13减轻了小鼠缺血再灌注24h后患侧海马神经元的损伤:与盐水对照组相比,GLYX-13干预组小鼠患侧海马CA3区以及DG区Fluoro Jade C阳性神经元的数量显著减少(###p0.001,n=5),此外CA1区Fluoro Jade C阳性神经元的数量也低于盐水对照组(#p0.05,n=5)。2.GLYX-13通过差异性调节NMDA受体NR2亚基进而对损伤脑组织发挥神经保护性作用。(1)Western blot实验结果:GLYX-13显著地下调了MCAO小鼠再灌注4h后脑组织中的p-NR2B(Tyr1472)的表达(#p0.05,n=6)并且上调了p-NR2A(Tyr1325)的表达(#p0.05,n=6);此外缺血再灌注24h后的小鼠受损伤影响其脑组织中NR2A型NMDA受体的表达明显减少而GLYX-13的干预有效地预防了NR2A亚型的损失(#p0.05,n=6)使得该亚型所介导的正常神经生理功能得以维持。(2)脑片全细胞膜片钳实验结果:(1)GLYX-13通过激活NMDA受体的甘氨酸辅助激动位点对抗脑组织缺氧时所产生的病理性的突触可塑性增强(post-ischemic Long Term Potentiation,i-LTP):长达5min的OGD使得海马CA1区锥体神经元在恢复能量供应后的EPSC的幅值显著持续增高(n=5,**p0.01),并且这种由OGD所诱导的EPSC病理性增益的现象可被特异性的NMDA受体拮抗剂AP-5所阻断,即证实了这种i-LTP的产生需要NMDA受体的参与。而GLYX-13干预组经历同样时长的OGD后其海马CA1区锥体神经元在恢复能量供应后的EPSC的幅值明显低于单纯OGD损伤组(n=5,##p0.01),并且D-serine能够完全抵消GLYX-13对于i-LTP的抑制效应。(2)GLYX-13参与调节脑组织能量剥夺条件下NMDA受体亚基的组成:给予海马脑片长达5min的OGD处理后,海马CA1区锥体神经元含有NR2B亚基的NMDA受体所介导的EPSC的幅值显著增高并同时伴随着总的NMDA-EPSC幅值的增高(n=5,**p0.01),而含有NR2A亚基的NMDA受体介导的EPSC的幅值只有轻微增高,与对照组的差异不具有统计学意义。值得注意的是GLYX-13干预组NR2B-EPSC以及NMDA-EPSC的幅值显著低于单纯OGD损伤组(n=5,##p0.01)。(3)在体MCAO模型TTC染色结果:(GLYX-13+Ro256981)处理组与单纯GLYX-13干预组相比未能表现出额外的神经保护性效应(n=6,p0.05);而(GLYX-13+NVP-AAM077)处理组和(GLYX-13+D-serine)处理组分别与MCAO模型盐水对照组相比并未表现出神经保护性效应(n=6,p0.05)。即NMDA受体甘氨酸位点全效激动剂以及NR2A亚基的特异性拮抗剂的应用均能够消除GLYX-13对缺血性神经元损伤的改善作用。这便进一步证实了GLYX-13是通过作用于NMDA受体的甘氨酸辅助激动位点调节NMDA受体的NR2亚基构成从而发挥对缺血性神经元损伤的保护性作用。结论:1、GLYX-13对MCAO模型小鼠具有神经保护性。2、GLYX-13通过对NMDA受体NR2亚基的差异性调节对脑缺血性神经元损伤发挥保护性作用。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743

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