肌动蛋白纤维在颞叶癫痫模型苔藓纤维突触的差异性重构

发布时间：2018-11-01 10:56

【摘要】：癫痫脑内突触连接发生持久的结构性改变是癫痫形成的病理机制之一。肌动蛋白纤维的解聚和聚合是突触重塑的主要驱动力。但是由于缺乏理想的检测手段，目前对癫痫中F-actin机制研究甚少。本研究通过C57BL/6小鼠的匹鲁卡品癫痫持续状态后模型、戊四唑化学点燃模型，采用Phalloidin特异标记F-actin，结合突触前后标记及蛋白检测方法，，研究F-actin在癫痫病理进程中的变化规律，进一步明确癫痫的发病机制，以期为临床治疗癫痫提供新的方向。目的：研究F-actin在癫痫病理进程中的变化规律，为攻克癫痫提供新的理论依据。方法：采用C57BL/6小鼠，制备两种颞叶癫痫模型—匹鲁卡品癫痫持续状态后自发性发作模型和PTZ化学点燃模型，应用phalloidin特异性标记小鼠海马F-actin，采用synapsin I、PSD95抗体进行突触前、后标记，利用F-actin/synapsinI和F-actin/PSD95双重染色分析F-actin在突触前后分布，结合F/G比值测定、PSD95、synapsin I、cofilin、p-cofilin Western Blot分析，研究F-actin在颞叶癫痫模型中的变化规律。结果： 1.匹鲁卡品癫痫持续状态后模型：（1）模型成功率：160只小鼠中，62.5%（100/160）达到癫痫持续状态，其中19只存活，成功率为11.88%（19/160），死亡率50.62%（81/160）。所有达到癫痫持续状态并存活的小鼠在2个月后均观察到了自发性发作现象。（2）C57BL/6小鼠匹鲁卡品癫痫持续状态后模型急性期、静止期及慢性期F-actin表达变化：在模型急性期（6小时）,F-actin荧光强度明显降低；而在静止期（48小时、10天），F-actin染色荧光强度逐渐恢复；在慢性期（癫痫持续状态后2个月），F-actin荧光强度再一次降低，并且F-actin阳性颗粒的形态及分布发生了变化。（3）匹鲁卡品模型慢性期Nissl、Timm、GFAP染色结果：Nissl染色结果显示与对照小鼠相比，匹鲁卡品癫痫持续状态后小鼠的海马CA1-CA3区锥体细胞出现了明显的细胞缺失，而齿状回颗粒细胞出现了明显增生（p0.05）。Timm染色结果显示实验组小鼠齿状回出现苔藓纤维发芽，齿状回内分子层Timm染色阳性颗粒较对照组明显增多（p0.05）。 GFAP染色显示匹鲁卡品模型慢性期海马CA3区GFAP染色明显增强(p0.05)。（4）匹鲁卡品模型慢性期F-actin变化：在低倍镜下可见实验组较对照组CA3区透明层F-actin染色的荧光强度略有降低。在高倍镜下，匹鲁卡品组F-actin阳性颗粒数量明显减少并且增大。统计分析显示实验组每平方微米的阳性面积和阳性数目较对照组显著减少（p0.05）。但平均每个F-actin颗粒的面积明显增大（p0.05）。Western blot结果显示匹鲁卡品组小鼠海马F/G比值较对照组显著下调（p0.05）。（5）匹鲁卡品模型慢性期synapsin I染色及Western blot结果：在低倍镜下，可见实验组CA3区透明层synapsin I染色荧光强度较对照组略有降低。在高倍镜下，可见实验组较对照组synapsin I颗粒明显增大，数量明显减少。统计分析结果显示，实验组每平方微米的阳性面积与对照组无显著差异（p0.05）。但阳性数目明显减少、平均每个synapsin I颗粒的面积明显增大（p0.05）。Western blot数据显示，匹鲁卡品癫痫持续状态后小鼠海马synapsin I表达变化不明显（p0.05）。（6）匹鲁卡品模型慢性期PSD95染色及Western blot结果：与对照组相比，实验组CA3区透明层的PSD95每平方微米阳性面积明显减少（p0.05）。Westernblot数据显示，与对照组相比，点燃组PSD95表达明显下调（p0.05）。（7）匹鲁卡品模型慢性期F-actin/synapsin I和F-actin/PSD95双重染色结果：F-actin与synapsin I双重染色结果显示二者共存的总面积在实验组较对照组明显减少，而二者在每处共存的面积却明显增大（p0.05）。F-actin与PSD95的双重染色显示，PSD95阳性颗粒与F-actin阳性颗粒大部分重合。 2. PTZ化学点燃模型：（1）模型成功率：在每日给药组，80%（12/15）小鼠被成功点燃，平均时间为19.7+/-5.3天（n=12）；每隔48小时注射组，只有46.7%（7/15）小鼠被成功点燃，平均给药次数为30.0+/-20.3次（n=7）。（2）Nissl和Timm染色结果：Nissl染色结果显示PTZ点燃小鼠的海马CA1-CA3区锥体细胞只出现了轻度细胞缺失，CA3b区细胞计数统计分析显示组间无显著性差异（p0.05）。Timm染色结果显示PTZ点燃小鼠齿状回及CA3区未出现苔藓纤维发芽。而在CA3区透明层，点燃组小鼠Timm染色加深（p0.05）。（3）F-actin标记及F/G比值测定结果：在高倍镜下，点燃小鼠CA3区透明层F-actin阳性颗粒数目明显增多。统计分析显示点燃组的F-actin每平方微米的阳性面积和阳性数目较对照组显著增加（p0.05）。Western blot数据显示，点燃组的F/G比值显著上调（p0.05）。（4）synapsin I免疫组化染色及Western blot结果：高倍镜下可见点燃组CA3区透明层synapsin I染色的阳性面积和每个颗粒大小与对照组相比明显增加。统计分析显示两组间差异性显著（p0.05）。Western blot分析结果也显示点燃组synapsin I的表达较对照组明显上调（p0.05）。（5）PSD95免疫组化染色及Western blot结果：点燃组CA3区透明层的PSD95荧光强度明显降低，统计分析显示PSD95每平方微米阳性面积显著降低（p0.05）。Western blot数据显示点燃组PSD95表达明显下调（p0.05）。（6）F-actin/synapsin I和F-actin/PSD95双重染色结果：F-actin与synapsin I双重染色显示，在CA3区透明层，在高倍镜下可见到Factin染色阳区（绿色）有一条窄带与synapsin I阳性区（红色）周围相重合（黄色），与对照组相比，点燃组黄色面积明显增加（p0.05）。F-actin与PSD95的双重染色显示，PSD95阳性颗粒与F-actin阳性颗粒大部分重合，但二者分布并不完全一致。结论：（1）在C57BL/6小鼠苔藓纤维末端突触，F-actin与synapsin I共存于突触前区；（2）匹鲁卡品诱导的癫痫持续状态后，在模型急性期，CA3区透明层F-actin荧光强度明显降低；而在静止期，F-actin染色荧光强度逐渐恢复；在慢性期，F-actin荧光强度再一次降低，并伴有形态改变；（3）匹鲁卡品诱导癫痫持续状态后模型慢性期，C57BL/6小鼠海马出现明显的神经元缺失及齿状回苔藓纤维发芽、胶质细胞增生；（4）匹鲁卡品模型慢性期，C57BL/6小鼠CA3区透明层F-actin下降及形态学重构主要发生在突触后区，并可能与模型慢性期的自发性发作密切相关；（5）PTZ点燃未引起引起C57BL/6小鼠海马明显的神经元缺失及苔藓纤维发芽；（6）点燃后C57BL/6小鼠CA3区透明层F-actin在突触前后表现出差异性重构—在突触前表达增多，在突触后表达减少。这种重构的结果很可能与点燃模型的惊厥易感性有关。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

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