活化小胶质细胞通过proNGF-JNK-Jun信号途径诱导多巴胺神经细胞凋亡的作用研究

发布时间：2018-11-06 14:18

【摘要】：研究目的帕金森病（Parkinson’s disease, PD)是由于黑质部位大量的多巴胺神经元丢失与死亡引起的中枢神经退行性疾病，其发生机制是基础和临床面临的重要问题。近年研究发现，脑内胶质细胞产生的神经营养素（neurotrophins, NT）前体分子参与脑发育、脑损伤过程，例如，神经生长因子前体（pro-nerve growth factor, proNGF）能够与其受体p75NTR和sortilin高亲和力结合，启动神经细胞凋亡程序引起神经元的凋亡发生，proNGF在这个过程中发挥着重要的作用。研究表明，在黑质多巴胺神经元发育、生存和功能活动中，胶质细胞同样发挥重要的调节作用。其中，胶质细胞能够产生合成多种神经营养素和前体分子，胶质细胞异常活化及其产生的神经营养素前体如proNGF是否具有生物活性和疾病意义，是有待阐明的重要问题。本课题拟着重研究小胶质细胞被LPS激活后proNGF是否合成和释放到细胞外、是否具有细胞生物效应功能、通过什么信号途径诱导多巴胺神经元凋亡或死亡等问题，分析神经炎症反应中小胶质细胞的发挥细胞毒性作用的新途径，为深入理解活化胶质细胞及其异常释放proNGF、参与帕金森病病理发展机制、以及探索新的疾病干预治疗策略提供实验依据。研究方法 1）采用大鼠黑质内立体定位注射LPS方法，建立炎性反应的动物模型。 2）通过免疫组织化学、双标记、激光共聚焦显微镜观察方法，研究proNGF、CD11b、Iba1在黑质多巴胺能神经元及小胶质细胞的定位表达与变化。 3）通过N9、BV2小胶质细胞培养方法，检测proNGF、proBDNF、proGDNF、MMP-9细胞定位及蛋白表达水平与变化情况。 4）通过Western-blot方法分析SH-SY5Y细胞proNGF、p75NTR、sortilin表达情况。 5）采用TUNEL、Hoechst/PI、CCK-8等方法，显示分析SH-SY5Y细胞凋亡。 6）采用细胞信号检测方法，分析JNK、JUN信号参与细胞凋亡机制问题。主要结果 1.发现LPS刺激N9/BV2小胶质细胞的功能活化、proNGF蛋白分子的表达上调和细胞外释放发生 1）建立N9/BV2小胶质细胞培养体系、LPS诱导炎症反应细胞模型，，证明LPS刺激N9、BV2小胶质细胞的Iba1阳性表达上调、阿米巴样形态变化和功能活化。 2）通过免疫细胞化学和Western blot方法，发现LPS能够刺激N9、BV2小胶质细胞的proNGF表达显著上调。 3）通过Western blot检测方法，发现LPS刺激能够诱导N9小胶质细胞的proNGF向细胞外释放。 2.外源性给予重组proNGF能够诱导SH-SY5Y多巴胺能神经细胞的凋亡，表明proNGF具备细胞生物效应 1）建立SH-SY5Y多巴胺能神经细胞培养体系，用于神经细胞毒性效应检测。 2）通过TUNEL、Hoechst/PI、caspase3检测方法，发现给予外源性重组proNGF（rhproNGF）能够诱导SH-SY5Y细胞凋亡或死亡，但对细胞活力没有显著影响。 3）动物实验证明LPS能够刺激黑质内小胶质细胞的活化和proNGF表达上调，并伴有多巴胺神经元的变性，提示其参与疾病状态下的神经炎症过程。 3. proNGF诱导SH-SY5Y细胞JNK、c-jun表达和磷酸化水平升高，表明JNK/c-jun信号激活可能参与proNGF生物效应过程 1）采用SH-SY5Y培养体系，发现给予外源性重组proNGF能够诱导SH-SY5Y细胞的JNK、c-jun表达上调和磷酸化水平提高，提示JNK-c-jun信号的激活参与proNGF的生物效应过程。 2）采用细胞信号通路抑制剂干预实验，初步分析LPS诱导小胶质细胞活化proNGF合成、及其proNGF诱导神经细胞凋亡的可能机制，通过LPS组、LPS+IWR1（Wnt信号通路抑制剂）组、LPS+GSI（Notch信号通路抑制剂）组和对照组等比较分析，初步提示Wnt和Notch信号通路与激活可能参与小胶质细胞活化和proNGF产生过程，但其确切机制有待深入的研究阐明。初步结论与意义本研究的主要发现是LPS诱导小胶质细胞活化并上调合成和释放proNGF、并能激活JNK-JUN信号途径、诱导多巴胺神经细胞的凋亡发生，该结果为深入理解小胶质细胞参与神经炎症反应或细胞毒性效应、以及参与神经退行性疾病的发生发展机制提供了新的实验证据，具有一定的理论和潜在应用意义。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5

【共引文献】