大鼠毛囊神经嵴干细胞向运动神经元的诱导分化

发布时间：2018-11-09 15:12

【摘要】：研究目的：运动神经元病（Motor Neuron Disease，MND）是一组由运动神经元慢性进行性变性导致的神经系统疾病，是临床常见病，发病率较高的MND主要有肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）、进行性脊髓性肌萎缩（progressiveSpinal Muscular atrophy，pSMA）、进行性延髓性麻痹（Progressive bulbar palsy，PBP）及原发性侧索硬化（Primary Lateral Sclerosis，PLS）等，临床缺乏有效的治疗手段，而干细胞的移植治疗是目前的研究热点。而干细胞移植治疗MND所涉及的一系列问题如干细胞的来源、干细胞向运动神经元诱导分化的方法及干细胞源性运动神经元在体内的功能和稳定性等，都没有得到很好的解决。因此，对这些问题进行深入的研究、评估其可行性将具有重要的理论价值和实际意义。毛囊神经嵴干细胞（hair follicle neural crest stem cells，hfNCSCs）广泛存在于毛囊隆突部，属于神经嵴来源干细胞，在自然分化条件下可分化为神经细胞。在我们实验室前期工作中已成功将hfNCSCs诱导分化为神经元样细胞，并观测到hfNCSCs源性神经元样细胞可以移植修复周围神经不同距离的缺损。鉴于hfNCSCs具有可来源于自体、易于获取、活性好、体内成瘤的几率较低等优点，值得作为运动神经元的来源干细胞进行深入的研究和探讨。目前对于干细胞向运动神经元的诱导分化已进行了较为广泛的探索，研究中所涉及的诱导物质和方法，如维甲酸（Retinoic Acid，RA）和音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）、曲古柳菌素（Trichostatin A，TSA）、8-Br-cAMP、咯利普兰（Rolipram，Rp）以及RG108等各有优缺点，尚无一种理想的诱导分化方案。为解决运动神经元的来源问题，本研究拟以大鼠hfNCSCs为种子细胞，应用RA、Shh联合TSA、8-Br-cAMP、Rp、RG108，诱导hfNCSCs向运动神经元分化，研究诱导分化细胞的形态结构变化，特异性基因、蛋白的表达以及在体内的稳定性和能否行使运动神经元的功能，以探讨干细胞源性运动神经元移植治疗神经系统疾病的可行性。研究方法： ⑴大鼠hfNCSCs的分离、培养、扩增及鉴定：采用组织贴块法分离、培养、扩增大鼠hfNCSCs，并检测Nestin（神经干细胞表面标记）、Sox10（神经嵴来源干细胞标记）的表达。 ⑵大鼠hfNCSCs向运动神经元的诱导分化：将扩增后的hfNCSCs应用RA、Shh联合小分子化合物如8-Br-cAMP、Rp、TSA、RG108等进行诱导分化，并对诱导后细胞检测运动神经元标记β-Tubulin Ⅲ、MAP2、ChAT、HB9、Olig2及Islet-1等的表达。 ⑶大鼠hfNCSCs源性运动神经元样细胞体内功能和稳定性检测：构建大鼠坐骨神经损伤动物模型并根据分组情况进行细胞移植，大鼠hfNCSCs源性运动神经元样细胞移植组（简称诱导细胞组，注射大鼠hfNCSCs源性运动神经元样细胞），大鼠hfNCSCs组（注射hfNCSCs）和PBS组（注射无菌PBS），分别于术后2w、4w、8w和12w检测记录各组动物的试验情况，对坐骨神经传导速度、坐骨神经髓鞘厚度、腓肠肌湿重进行检测并分析。结果： ⑴经过组织贴块法分离、培养、扩增得到的大鼠hfNCSCs活性好、增殖速度快、细胞形态规则、大小一致，且纯度较高，约有97.78%的细胞Nestin+、92.67%的细胞Sox10+。 ⑵经过RA、Shh与8-Br-cAMP、TSA、Rp、RG108等的联合诱导分化，大鼠hfNCSCs呈多突起的神经元样形态，免疫荧光化学结果显示运动神经元特异性标记如HB9、ChAT、Islet-1、Olig2等均有阳性表达，且基因、蛋白水平也有表达，约有50%的大鼠hfNCSCs诱导分化为运动神经元样细胞。 ⑶大鼠hfNCSCs源性运动神经元样细胞可以在坐骨神经内存活、增殖，，并维持运动神经元的功能与特性。结论： ⑴hfNCSCs可作为临床移植运动神经元的来源干细胞； ⑵RA、Shh联合8-Br-cAMP、TSA、Rp、RG108可有效促进大鼠hfNCSCs向运动神经元分化。 ⑶大鼠hfNCSCs源性运动神经元样细胞在周围神经内可以存活、增殖，并可维持运动神经元的功能与特性。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741

【参考文献】