脑胶质瘤靶标CPEB4参与增殖侵袭的分子机制及预后相关性研究

发布时间：2018-11-17 07:07

【摘要】：脑胶质瘤是一类常见、难治、重要的危害人类健康疾病，其中恶性胶质瘤占所有原发恶性脑肿瘤的80%，预后差，病死率高，即使手术切除后复发率仍高达70%~90%，胶质母细胞瘤与间变型星形胶质瘤的中位生存期分别只有12~15个月与2~5年，5年生存率分别仅为4.7%和25.9%。尽管随现代科技进步，新技术和新药物不断应用，手术、放化疗、免疫、基因治疗或其组合的综合措施取得了一定进展，但恶性胶质瘤的总体预后并未得到根本的改善，因此，阐明脑胶质瘤分子病理机制，寻找新的治疗靶点和策略以及可用于判断预测脑胶质瘤预后的相关分子靶标，从而提高胶质瘤的综合疗效已成为神经外科领域的前沿课题。脑胶质瘤的恶变是基因畸变的积累与生长因子信号通路异常调控的结果，这一过程包含了PI3K、p53、RB、MAPK等多条通路，并可能涉及到肿瘤细胞粘附、基质降解、迁移、细胞增殖等诸多环节，但目前其具体的机制仍不清楚。因此，脑胶质瘤治疗取得突破的关键因素就是找到其发生、增殖、侵袭过程中的上游核心调控基因，针对这些关键调控基因的分子靶向疗法则是胶质瘤治疗的新思路和新方向。挖掘出既能反应胶质瘤的生物学特性，又能辅助制定放化疗策略和预测预后的特征性分子靶标具有重要的临床意义，以实现真正意义上的分子靶向治疗。高通量技术的出现无疑为分子靶向治疗的实现提供强有力的工具。利用二代测序、基因芯片、组织芯片等技术不仅能对肿瘤样本进行分析，分辨疾病的亚型，还可以预测疾病的预后和对药物、放射线的敏感性，进而实施个体化治疗。在治疗中我们发现，即使是相同病理类型和级别的胶质瘤，同样的治疗方法，其治疗效果也存在着很大的差异。肿瘤的内在分子水平上的差异是导致这一现象的最关键因素。若在治疗前，就能预先发现特殊的肿瘤基因的突变、缺失等各种表型改变，进而可判断患者对治疗的反应和预后，则毫无疑问能为治疗提供更多的选择性和针对性并可能显著提高疗效。目前已有文献报道MGMT、IDH1、1p/19q等多个基因的甲基化、突变或缺失可用于判断部分胶质瘤亚型对替莫唑胺等化疗药物的敏感性，并且可作为预后判断的重要指标，但这些著名靶标尚没有胶质瘤的特异性。近年来，转录后水平的调控分子在肿瘤发生发展过程的作用不断被揭示，越来越多的证据表明，特定mRNA的转录后调控与肿瘤相关基因表达水平变化密切相关，且这种调控主要是通过3'非翻译区的顺式作用元件实现的。胞质聚腺苷酸化元件（Cytoplasmic polyadenylation element，CPE）即为已知的元件之一，在上百种涉及细胞增殖及分化的mRNA上均有表达。CPE结合蛋白（CPEB）是一组高度保守，包含有RNA识别序列及锌指结构的RNA结合蛋白，能够促进多聚腺苷酸化诱导的翻译过程并能介导包括干细胞发育、细胞分化和细胞衰老等过程。CPEB4是CPEB家族中的一员，已有研究发现其在胰腺癌组织中过表达，且表达水平高低与肿瘤恶性程度成正相关；另有文献报道CPEB4在GBM中过表达（同一篇文献？），但CPEB4表达量与肿瘤恶性程度、发生发展、增殖侵袭及预后的关系，国际上尚无文献报道。因此，本实验从组织水平和细胞水平，通过高通量组织芯片、靶向RNA干扰慢病毒载体构建、RT-PCR、Western blot，以及细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等体外实验方法，探索研究CPEB4蛋白表达量与患者预后的关系，并初步探讨其在胶质瘤细胞中的功能表型及可能的通路和分子机制。第一部分：CPEB4在脑胶质瘤组织中的表达及预后相关研究目的：CPEB4是CPEB家族中的重要一员，在细胞生理和病理过程中，调控有丝分裂、减数分裂细胞周期及细胞衰老，其在转录后调控中的重要作用，提示可能与肿瘤发生、发展密切相关，但其在胶质瘤领域中研究尚很少。本部分实验通过构建高通量组织芯片和免疫组化的方法，研究CPEB4在各级别胶质瘤组织中的表达情况，并分析CPEB4的表达量与胶质瘤预后的关系。方法：1）、收集经临床病理证实为胶质瘤的病理标本共计300例（通过2000年1月至2010年12月第二军医大学长征医院神经外科肿瘤切除手术取得）；正常脑组织16例（通过外伤减压手术取得）；制备成高通量的胶质瘤组织芯片；2）、利用组织芯片、免疫组化方法研究CPEB4在肿瘤细胞中的亚定位及其蛋白在各个级别胶质瘤和正常脑组织中的表达情况，并分析级别与表达量的关系；3）、对300例胶质瘤患者进行随访，获得其生存期，分析CPEB4表达量与胶质瘤患者生存期的关系。结果：在正常脑组织中CPEB4主要表达在神经元内，在胶质细胞中表达很少；在胶质瘤细胞中CPEB4主要表达在胞浆内，各级别胶质瘤中的表达均高于正常脑组织(P0.05)，其表达强度随级别增高而增高，呈正相关，低级别和高级别胶质瘤之间的表达差异具有统计学意义(P0.05)；CPEB4的表达量与胶质瘤患者的预后有相关性，Log-rank单因素分析显示CPEB4表达高者的总体生存期（OS）和无进展生存期（PFS）较CPEB4表达低者均明显缩短，统计学差异显著（P值均＜0.001），但经病理级别校正后P值分别为0.065和0.059，提示CPEB4表达量与胶质瘤患者预后的相关性受到病理级别的影响。在原发GBM中，Log-rank单因素分析显示高表达CPEB4患者的OS和PFS均明显低于低表达者（两者p值均为0.011），Cox多因素分析显示CPEB4表达水平是原发GBM患者OS和PFS的独立预后相关因素（OS:HR=2.017, p=0.003；PFS: HR=1.810,p=0.009）。结论：正常脑组织中CPEB4仅少量表达在神经元中。胶质瘤细胞中CPEB4主要表达在细胞胞浆内，其表达水平与胶质瘤病理级别密切相关，提示CPEB4可能参与到胶质瘤的发生发展、增殖侵袭等过程中。在原发GBM患者中，CPEB4表达量与预后相关性显著，是原发GBM患者预后的独立相关因素，提示CPEB4是一个潜在的原发GBM的预后判断靶标。第二部分：CPEB4参与胶质瘤增殖侵袭的体外实验研究和机制探索目的：在上一部分中我们已证明CPEB4在胶质瘤组织中呈高表达，且其表达水平随肿瘤病理级别升高而上升，呈正相关，提示CPEB4可能与胶质瘤的恶性生物学行为密切相关。在本部分中，拟构建靶向CPEB4干扰的稳定慢病毒载体，转染胶质瘤细胞，在体外实验中研究CPEB4表达水平改变对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响，，并探讨可能的通路和机制。方法：1）设计siRNA靶点，合成高效干扰序列，与慢病毒载体连接，并利用荧光显微镜，定量RT-PCR、Western blot验证RNA干扰效果；2）靶向CPEB4的RNA干扰慢病毒载体感染胶质瘤T98细胞后，MTT法检测细胞增殖曲线变化、流式细胞仪测肿瘤细胞周期与凋亡；3）、荧光定量PCR检测CPEB4表达量改变后胶质瘤增殖、侵袭、耐药等相关分子表达量的变化。结果：靶向CPEB4的RNA干扰和过表达慢病毒载体感染胶质瘤细胞后有效的改变了细胞内源性CPEB4的表达水平，与对照组相比差异显著。CPEB4表达量降低后，胶质瘤细胞增殖能力减弱，细胞周期停滞于G1期，但细胞凋亡无明显改变。CPEB4表达量降低后，肿瘤相关重要分子SMAD3、PIK3CA和IGF2的mRNA表达水平明显降低。结论：CPEB4参与调控了胶质瘤细胞的增殖侵袭，SMAD3、PIK3CA、IGF2可能参与其中发挥作用。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

【共引文献】