【摘要】：目的：围产期窒息引起的新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)可导致幸存新生儿出现严重的认知障碍,其机制可能与缺氧缺血导致的髓鞘化障碍有关,但是,HIE后髓鞘化障碍的发生机制不清。本课题从微管相关蛋白(MAPs)、离子型三磷酸腺苷(ATP)受体与米诺环素的神经保护作用入手,研究系统性缺氧后新生鼠脑tau蛋白及其磷酸化水平、谷氨酸与髓鞘碱性蛋白(MBP)的动态变化,探讨ATP受体P2X4亚型在HIE后远期行为异常中的作用机制以及米诺环素对HIE神经保护作用的可能机理。方法：1POd SD大鼠系统性缺氧3.5h,建立新生鼠HIE模型。随机分为正常对照组(NG)、缺氧组(Hy)、吡多醛磷酸盐-6-含氮(苯-2,4-二磺酸)四钠盐水合物组(PPADS选择性阻断P2X1-3,5-7受体lOmg/kg ip, Hy P)和2’,3’-0-(2,4,6-三硝基苯基)腺苷5’-三磷酸盐组(TNP-ATP阻断P2X1-7受体2mg/kg ip, Hy T),米诺环素组(45mg/kg ip,之后减至22.5mg/kg ip,连续6天,Hy M)。2.P60d大鼠进行T2加权成像(T2WI)及弥散张量成像(DTI),观察大鼠脑白质及髓鞘发育的情况。3.透射电镜(TEM)观察大鼠胼胝体(CC)及海马CAl超微结构的变化。4.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测大鼠MBP,总tau蛋白及Thr205、Thr231、Ser396、Ser404、Tyr18位点磷酸化水平的动态变化。5.经液相色谱-串联质谱联用技术(LC/MS/MS)检测大鼠脑内谷氨酸水平的动态变化。结果：1.T2WI：缺氧后大鼠出现脑室扩大,侧脑室三角区T2信号增高。CC变薄,白质丢失。DTI:CC尤其是胼胝体中部(CCM) (CC p0.01,CCM p0.001 vs NG)各向异性分数(FA)明显下降。阻断P2X4受体／米诺环素干预后上述病变改善,CC及CCMFA值升高(Hy T vs Hy:CC p0.01, CCM p0.001; Hy M vs Hy:CCp0.01, CCMp0.01)。2.TEM：缺氧导致大鼠CC少突胶质细胞(OLs)坏死(4h、1d),髓鞘分层、溶解(14d、30d),海马CA1神经元受损、神经毡水肿。阻断P2X4受体／米诺环素干预后髓鞘形态及完整性得到修复。3. SDS-PAGE电泳：OMBP：正常大鼠在出生后早期(4h、1d)脑室周围区域即出现MBP表达。其表达在缺氧后3d下降,4h、7d和14d增高(p0.05 vsNG)。阻断P2X4受体可抑制系统性缺氧后7d MBP水平(p0.05 vs Hy),但是PPADS/米诺环素干预不能影响MBP的病理性表达(p0.05 vs Hy)。②总tau蛋白及其磷酸化水平：脑室周围,总tau蛋白在缺氧后7d和14d增高(p0.05 vs sNG),P2X4受体阻断不能抑制其病理性表达(p0.05 vs Hy)；pT205在缺氧后4h、3d和14d增高(p0.05 vs NG), TNP-ATP (p0.05 vs Hy)及PPADS (p0.01 vs Hy)治疗可抑制14d时pT205水平;pT231在缺氧后4h、1d下降,7d增高(p0.05 vsNG),阻断P2X4受体可抑制7d时pT231水平(p0.05 vs Hy)；pS396在缺氧后7d增高(p0.05vsNG),阻断P2X4受体可抑制其病理性磷酸化(p0.05 vs Hy)。海马,总tau蛋白在3d升高,7d降低(p0.05 vsNG)；pT231在3d降低,7d增高(p0.05 vsNG),pT205及pS396水平未发现异常(p0.05 vsNG)。P2X4受体阻断不能抑制海马tau蛋白病理性表达及磷酸化(p0.05 vs NG)。 Ser404和Tyr18在各观察时间点未出现病理性磷酸化(p0.05 vs NG)。米诺环素不能抑制系统性缺氧后脑tau蛋白病理性表达及磷酸化(p0.05 vs Hy)。本研究经统计学分析还发现,缺氧后总tau蛋白与MBP病理性表达间存在相关性(p0.01,r=0.5865)。4LC/MS/MS:缺氧后4h及1d脑室周围谷氨酸水平增高(p0.05 vs NG)。P2X4受体阻断可下调谷氨酸水平(p0.05 vs Hy),而阻断其它亚型P2X受体仅在4h对谷氨酸有抑制作用(p0.051 vs Hy)。米诺环素对系统性缺氧后脑内谷氨酸水平没有抑制作用(p0.05 vs Hy)结论：1.HIE后,P2X4受体活化引起大鼠脑髓鞘化障碍。2.HIE后tau蛋白病理性磷酸化集中于脑室周围区域,为该区域的选择性易损现象提供了新的依据。3.Tau蛋白病理性表达及磷酸化是新生鼠HIE后髓鞘化障碍发生的可能机制。4.P2X4活化介导大鼠脑室周围谷氨酸上调,诱导tau蛋白的病理性磷酸化,进而导致HIE后大鼠髓鞘化损伤及远期行为异常。5.米诺环素对HIE后髓鞘损伤具有修复作用,但并非通过抑制谷氨酸以及tau蛋白病理性磷酸化途径实现。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742
【共引文献】
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2347075
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