脑出血后的红细胞溶解清除与谷氨酸毒性中RNF146作用的研究

发布时间：2018-11-24 14:50

【摘要】：研究背景脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是一种常见的神经系统疾病,具有很高的发病率与死亡率。它在每年新发的卒中病例中大约占有10%-15%的比例,这个比例随着人口平均寿命的增加而增长。在过去几十年里,ICH总的发病率与死亡率没有显著下降,其30天的死亡率约为30%-50%,并且只有20%的病人能在6个月后恢复自理能力。脑出血后大量的红细胞进入脑实质中,这些红细胞在早期就开始溶解并释放出血红蛋白。血红蛋白在损伤部位降解,最终的降解产物包括铁、胆绿素、一氧化碳等,其中铁能够引起一系列下游分子反应,如引起谷氨酸释放,氧化应激反应等。这些应激性反应,引起脑出血后早期的脑水肿、血脑屏障破坏以及神经元变性等大脑损伤。脑出血后引起的一系列继发性分子病理事件是造成进一步损伤的主要机制,尤其是谷氨酸损伤引起的钙离子浓度升高以及氧化应激反应。RNF146是一种泛素化E3连接酶,研究认为它在脑缺血后具有神经保护作用。但是,RNF146在谷氨酸损伤中的具体保护机制并不清楚。脑出血后若能及时清除血红蛋白减少其代谢产物的生成,能够极大减少神经系统损害以及谷氨酸过量释放等继发性改变,同时使用RNF146治疗可以减少其下游分子事件引起的继发性损害。该研究结果提示:(1)脑出血后4小时就可以发生红细胞溶解。(2)血红蛋白代谢产物铁可以引起血红蛋白清除受体(CD163)与Haptoglobin的升高。(3)谷氨酸损伤可以引起神经细胞发生自噬。(4)RNF146可以通过调控谷氨酸诱导的自噬发挥神经保护作用。本研究主要分为以下三个方面:第一部分:脑出血后早期红细胞溶解的作用与机制研究背景:脑出血后血液从破裂血管中大量进入脑实质中引起脑损伤。大量研究认为血液中的红细胞是导致脑损伤的重要因素。一般认为红细胞进入脑实质后在出血后一天左右开始溶解,溶解后释放出大量的血红蛋白引起脑肿胀与神经元死亡等。因此,红细胞的溶解程度与脑损伤程度密切相关。肝素是一种抗凝剂,能够减少血液的凝固。但是如何测定脑出血后红细胞溶解程度仍没有方法。肝素能否减慢红细胞的溶解仍不可知。方法:我们的实验分为三部分:首先,将SD大鼠分为两组,一组注射100μl盐水,另外一组注射100μl自体血。在4小时进行核磁扫描T2,T2*,并测量脑肿胀比率与红细胞溶解率。再次,将SD大鼠分为两组,一组注射50μl浓缩红细胞,另一组注射50μl溶解红细胞。在4小时进行核磁扫描T2,T2*以及R2*mapping,并测量脑肿胀比率与红细胞溶解率。此外,切片进行HE染色,Fluoro-Jade C染色。免疫组化染色与Western-blot检测Albumin蛋白水平。使用Matlab软件分析R2*mapping图像进行铁定量。最后,将SD大鼠分为两组一组注射100μl自体血加载体,另一组注射100μl自体血加5个单位肝素。在4小时同样进行T2,T2*以及R2*mapping。并进行HE染色,Fluoro-Jade C染色。结果:我们的实验结果证明脑出血后4小时已经发生中线移位。从T2*影像结果得出,红细胞溶解在4小时已经开始发生。此外,我们使用大鼠脑直接注射溶解红细胞与浓缩红细胞,观察在T2,T2*及R2*mapping上影像学变化。结果发现溶解红细胞组在T2*上损伤区显示为高信号区域,浓缩红细胞在损伤区为低信号区域。溶解红细胞组在4小时加重了脑肿胀程度。相比于浓缩红细胞组,溶解红细胞组引起的血脑屏障破坏更加严重。最后,我们研究肝素在脑出血后早期红细胞溶解中的作用。结果表明肝素可以减少早期红细胞溶解,并减少脑肿胀及神经元变性。结论:脑出血后红细胞的溶解会引起大脑肿胀,神经元变性以及血脑屏障的破坏。肝素可以减少早期的红细胞溶解,并且可以减轻脑肿胀及神经元变性。第二部分:脑出血后CD163与Haptoglobin(Hp)清除血红蛋白的机制研究背景:脑出血是一种在年长人群发生的致死性疾病,大量的红细胞在脑出血后进入脑组织细胞外间隙中。红细胞的降解产物包括血红蛋白,血红素以及铁,引起了验证的氧化与兴奋性毒性作用并且最终导致大脑损伤。血红蛋白来源于血红细胞溶解是脑出血后的主要损伤因素,血红蛋白的毒性与氧自由基的形成与一氧化氮的清除具有密切关系。脑出血后的铁超载可以造成大脑水肿以及大脑萎缩。前面的研究证明血红蛋白在脑出血后表达在神经元与胶质细胞中。然而,降解血红蛋白的保护机制仍然不清除。CD163属于富含半胱氨酸的清除受体超家族,它在血红蛋白的清除中发挥重要作用。同时CD163也是发挥抗炎作用小胶质细胞的标记物之一,它能够调节巨噬细胞中血红素氧化酶的激活。Hp是一种含量颇丰的血浆糖蛋白,能够与血红蛋白结合。Hp在内源性血红蛋白清除系统中具有重要作用,主要依赖于其对游离血红蛋白的解毒作用。Hp与血红蛋白构成的复合体与CD163有很高的亲和力。此外,研究发现Hp主要在大脑中主要由少突胶质细胞合成与分泌。方法:本实验主要分为四部分。第一部分,使用自体血注射脑出血模型检测CD163与Hp在第一天,第三天与第7天的表达变化。第二部分,使用Fe Cl2注射SD大鼠研究铁超载在大脑中的作用。第三部分,使用米诺环素研究其对铁毒性与脑出血后CD163与Hp的作用。第四部分,我们使用原代小胶质细胞研究CD163吞噬血红蛋白的清除作用。结果:我们发现CD163与Hp在脑出血第一天开始表达在皮层区神经元与基底节区小胶质细胞并且在第7天达到表达高峰。CD163主要表达在皮层神经元细胞与基底节区小胶质细胞上。Hp主要表达在基底节白质束区少突胶质细胞上。铁能够激活CD163与Hp在皮层区与基底节区的表达。米诺环素能够减少铁与脑出血引起的CD163与Hp表达。CD163抗体能够阻止小胶质吞噬血红蛋白的能力。结论:CD163与Hp在脑出血后一天表达升高并且在第7天达到表达高峰。铁能够增加CD163与Hp的表达,米诺环素治疗可以减少铁与脑出血后的CD163与Hp表达。CD163抗体可以拮抗小胶质细胞吞噬血红蛋白的能力。第三部分:RNF146对脑出血后谷氨酸兴奋性毒性诱导自噬的作用与机制研究背景:谷氨酸是一种中枢神经系统的内源性兴奋性神经递质。谷氨酸兴奋性毒性是造成卒中,创伤性脑损伤,神经系统退行性疾病等疾病后神经细胞死亡的主要因素之一。自噬参与降解受损或损毁的细胞器,异常蛋白质以及其他细胞质组分的主要代谢过程,是谷氨酸兴奋性毒性后的重要细胞代谢活动。RNF146是一种PAR依赖的E3连接酶,也是一种重要的调节分子,可以调控PARP1介导的细胞死亡。此外,RNF146还能够酶正性调控Wnt信号通路,这是因为RNF146参与了端锚聚合降解axin的过程。然而,目前还没有相关研究证明该通路在谷氨酸兴奋性毒性中的作用。RNF146在谷氨酸兴奋性毒性的作用及自噬及其下游分子通路仍然不清楚。方法:我们的目的是检测RNF146在谷氨酸兴奋性损伤后如何调控自噬。首先,使用RNF146过表达慢病毒与干涉慢病毒转染类神经元细胞HT22细胞系,并对这些细胞进行MTT实验与LDH细胞毒性实验。其次,我们观察自噬在谷氨酸兴奋性毒性损伤中的作用,使用了药理学试剂调控自噬观察HT22细胞的损伤程度。此外,我们还研究了RNF146与Wnt信号通路的相关性,使用Wnt拮抗剂干扰Wnt/β-catenin信号通路的转导过程。同时,为了研究Wnt信号通路在谷氨酸损伤后如何调控自噬,我们使用了Wnt信号的激动剂Foxy5,一种Wnt5a多肽类似物以及拮抗剂,JW74与IWP2。最后,我们还使用了Wnt/β-catenin信号通路抑制剂JW74去研究RNF146对自噬的负性调控作用。结果:本研究中,我们发现了上调RNF146能够减少谷氨酸兴奋性毒性引起的细胞损伤。RNF146能够抑制谷氨酸兴奋性毒性或者雷帕霉素引起的过度自噬,保护神经元不受到损伤。此外,我们还发现在谷氨酸兴奋性毒性中Wnt/β-catenin能够负性调控自噬。过表达RNF146能够通过抑制β-catenin降解复合体促进Wnt/β-catenin信号通路。结论:以上结果证明RNF146是一种神经保护分子,能够在谷氨酸兴奋性毒性损伤保护神经元不受到损伤。这种神经保护作用很有可能是依赖于调控Wnt/β-catenin信号通路抑制自噬。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.34
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本文编号：2354133