实验性自身免疫性重症肌无力的体液免疫调节

发布时间：2018-12-12 11:00

【摘要】：研究背景：重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是一种由抗体介导、T细胞依赖、补体参与的经典的器官特异性自身免疫性疾病,由于神经肌肉接头突触后膜上的乙酰胆碱受体损伤而导致神经肌肉接头处传递功能障碍。目前临床上针对重症肌无力的免疫治疗主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂,因其缺乏特异性,且需要长期应用,副作用较大,因此促使我们探索新的治疗策略和方法。树突状细胞(dendritic cells, DC)是体内最重要的专职抗原提呈细胞,根据其成熟状态的不同,既可以诱导免疫反应,也可诱导免疫耐受。他汀类药物是临床常用的抗动脉粥样硬化药物,近来研究发现其作用机制除降低血脂外,更重要的是其抗炎及免疫调节作用。我们的前期研究发现,应用阿托伐他汀在体外修饰脾脏来源的树突状细胞,可诱导树突状细胞呈不成熟状态。给实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)大鼠腹腔注射这些不成熟DC,可缓解EAMG的发展,减少抗体的产生。其机制主要是抑制了EAMG的细胞免疫反应,表现为抑制淋巴细胞增殖,上调调节性T细胞,使Th1/Th17细胞反应转化为Th2细胞反应。然而,他汀修饰的DC减少抗体产生的具体机制仍不明确,尤其是对体液免疫反应的影响及作用机制仍有待进一步研究。近来研究发现一群以CXCR5 (CXC chemokine receptor 5, CXC趋化因子受体5)、ICOS (inducible T-cell costimulator,诱导性协同刺激分子)、PD-1 (programmed death protein-1,程序性死亡受体1)、Bcl6 (B-cell lymphoma 6, B细胞淋巴瘤因子6)及IL-21为特征的新的细胞亚群,即滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells, Tfh)。Tfh直接辅助B细胞产生抗体,在体液免疫反应过程中发挥重要作用,因此在很多自身免疫性疾病的研究中备受关注。另外,调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)作为一群发挥负性调节作用的B细胞,其发现挑战了B细胞提呈抗原和分泌抗体的传统观点。因此,耐受性DC对EAMG大鼠的Tfh和Breg的影响也是本研究关注的重点。研究目的：探讨阿托伐他汀修饰的骨髓源性DC对EAMG体液免疫的调节及机制。研究方法：1. EAMG模型的建立及临床评分用大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)免疫Lewis大鼠,第11天加强免疫一次,建立EAMG模型。采用双盲法隔天进行观察并评分,评分标准参考Lennon评分方法,结果以每个时间点的平均数表示。2.骨髓源性DC的诱导、培养与表型检测无菌条件下取免疫后20天的EAMG大鼠的胫骨和股骨,冲洗骨髓腔得到骨髓细胞悬液,去除红细胞后接种于培养瓶中。贴壁3天,去除悬浮细胞后继续培养。第8天加入药物处理,他汀组(AT-BMDC)加入阿托伐他汀(10 μM),对照组(0-BMDC)加入等体积的DMSO (dimethysulfoxide,二甲基亚砜)。48 h后收集悬浮细胞,经流式细胞仪检测表面CD80、CD86及MHCII分子的表达情况。3. EAMG大鼠的分组与治疗将15只大鼠随机分为3组(5只／组),在免疫后第5天及第16天各给予一次腹腔注射治疗。AT-BMDC组给予他汀处理的DC(1×106个／只),0-BMDC组给予未用他汀处理的DC(1×106个／只),EAMG组给予等体积的1640培养基。4. ELISA检测抗体数量及亲和力于免疫后第43天处死大鼠,取心脏血,离心取血清。用R97-116肽段包板,采用ELISA方法检测血清中抗R97-116抗体的数量,用硫氰酸盐洗脱法检测抗体的亲和力。5.免疫荧光法检测脾脏中的生发中心免疫后第43天处死大鼠,取新鲜脾脏,液氮速冻后-80℃冰箱冻存。OCT包埋后切片,用PNA (peanut agglutinin,花生凝集素)染色,PNA+细胞代表生发中心内的B细胞。6.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的Tfh、IL-21+细胞及Breg取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD4、CXCR5、ICOS抗体检测Tfh细胞,加入CD19、IL-10抗体检测B10细胞,加入CD19、Foxp3抗体检测B-Foxp3 细胞。另外,用IL-21抗体检测IL-21+细胞。标记完成后经流式细胞仪检测。7.统计学分析应用SPSS17.0软件对资料进行统计分析,应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)或Kruskal-Wallis秩和检验进行组间比较,p0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.阿托伐他汀在体外诱导不成熟的骨髓源性DC流式细胞术检测发现,用阿托伐他汀处理DC后,其表面的CD80、CD86和MHCⅡ表达均明显降低,说明阿托伐他汀在体外可抑制DC成熟。2.他汀修饰的DC可缓解EAMG大鼠的症状与EAMG组相比,AT-BMDC组大鼠症状较轻,其临床评分在第13、24、34、36、38及42天差异具有统计学意义。与0-BMDC组相比,AT-BMDC组大鼠评分较低,但差异无统计学意义。另外,0-BMDC组与EAMG组相比,临床评分无明显差异。3.他汀修饰的DC可降低EAMG大鼠的抗体数量及亲和力ELISA检测发现,AT-BMDC组大鼠血清中的抗R97-116抗体数量较EAMG组及0-BMDC组明显降低。硫氰酸盐洗脱法显示,AT-BMDC组抗体亲和力低于EAMG组及0-BMDC组。4.他汀修饰的DC可抑制EAMG大鼠生发中心的产生对大鼠脾脏进行免疫荧光染色,结果显示,AT-BMDC组生发中心的数量明显少于EAMG组及0-BMDC组,说明他汀修饰的DC抑制EAMG大鼠生发中心的生成。5.他汀修饰的DC可抑制EAMG大鼠Tfh及IL-21流式细胞术检测CD4+T细胞中Tfh的比例,结果显示,AT-BMDC组Tfh细胞比例显著低于EAMG组及0-BMDC组。另外,检测淋巴结单个核细胞中IL-21+细胞的比例,结果显示,AT-BMDC组IL-21+细胞的比例低于EAMG组和0-BMDC组。6.他汀修饰的DC可上调EAMG大鼠调节性B细胞流式细胞术结果显示,AT-BMDC组CD19+B细胞比例低于0-BMDC组,与EAMG组比较,差异无统计学意义。与EAMG组比较,AT-BMDC组与0-BMDC组B-Foxp3细胞比例增高。与EAMG组及0-BMDC组比较,AT-BMDC组B10细胞略有增加,但差异无统计学意义。结论：1. 阿托伐他汀可在体外诱导不成熟的骨髓来源的DC,且这些不成熟DC可诱导EAMG的免疫耐受。2.他汀修饰的骨髓源性DC通过抑制抗体的数量和亲和力、减少生发中心、抑制Tfh和IL-21以及上调调节性B细胞来调节EAMG的体液免疫反应。研究背景及目的：Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinase, ROCK)是Rho GTP酶的重要下游底物。ROCK可磷酸化多种靶蛋白,在许多重要的生物学过程,如细胞收缩、形态改变、迁移、粘附、增殖、分化、凋亡、周期调控及基因表达中,发挥“分子开关”的作用。越来越多的证据表明,免疫细胞中也可表达Rho/ROCK通路成分,且与T细胞、B细胞的发育、活化和功能有关。研究报道,类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者体内Rho/ROCK通路活性增强。动物实验证实ROCK抑制剂可缓解自身免疫性疾病,如实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)和SLE的发展。重症肌无力(myasthenia gravis, MG)是一种经典的抗体介导的器官特异性自身免疫性疾病,临床表现为全身骨骼肌波动性无力和易疲劳。目前Rho/ROCK通路在MG中的作用尚不明确。研究发现,他汀类药物具有抗炎和免疫调节作用,这种作用部分依赖于其对Rho/ROCK通路的抑制,而他汀类药物的肌肉毒性限制了其在MG中的应用。法舒地尔是目前唯一应用于临床的特异性ROCK抑制剂,主要用于预防和治疗蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛。在本课题中我们选用法舒地尔治疗实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG),目的在于探索Rho/ROCK通路在MG中的作用及ROCK抑制剂法舒地尔对EAMG体液免疫反应的影响,并尽可能阐明其机制。研究方法：1. EAMG模型的建立及临床评分用大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)免疫Lewis大鼠,于免疫后第11天加强免疫一次,建立EAMG模型。采用双盲法隔天观察大鼠症状并评分,评分标准参考Lennon评分方法,结果以每个时间点的平均数表示。2. EAMG大鼠的分组与治疗将15只大鼠随机分为3组(5只／组),自免疫后第6天起每日给予腹腔注射不同剂量的法舒地尔(10 mg/kg及30 mg/kg),对照组给予相同体积的生理盐水。3.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞表面CD80、CD86及MHCⅡ分子免疫后第43天处死大鼠,取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD80、CD86及MHCⅡ抗体,标记后用流式细胞仪检测。4. 流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的细胞因子取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入细胞刺激阻断剂,培养4 h后收集细胞,标记CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)及CD4+IL-17+(Thl7)细胞及细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α,用流式细胞仪检测。5.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells, Tfh)及调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD4、CXCR5、ICOS抗体检测Tfh细胞,加入CD19、IL-10抗体检测B10细胞,加入CD19、Foxp3抗体检测B-Foxp3细胞,标记后用流式细胞仪检测。6. 免疫荧光法检测脾脏中的生发中心免疫后第43天处死大鼠,取新鲜脾脏,液氮速冻后-80℃冰箱冻存。OCT包埋后切片,用花生凝集素(peanut agglutinin, PNA)染色,PNA+细胞即为生发中心内B细胞。7. ELISA检测抗体数量及亲和力于免疫后第43天处死大鼠,取心脏血,离心取血清,-20℃冰箱冻存备用。用R97-116肽段包板,采用ELISA方法检测血清中抗R97-116抗体的数量,用硫氰酸盐洗脱法检测抗体的亲和力。8.统计学分析应用SPSS17.0软件对资料进行统计分析,应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)或Kruskal-Wallis秩和检验进行组间比较,p0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.法舒地尔可缓解EAMG大鼠的症状与EAMG组相比,经法舒地尔治疗的大鼠症状较轻。其中,大剂量组大鼠在免疫后第24天,以及自28天至43天,表现出明显降低的临床评分,且差异有统计学意义。小剂量组的临床症状较对照组减轻,但仅在第35天时差异有统计学意义。另外,小剂量组与大剂量组相比,临床评分无明显差异。2.法舒地尔抑制EAMG大鼠淋巴结单个核细胞上CD80的表达用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞上的CD80、D86和MHCⅡ分子,结果显示,与对照组相比,大剂量组单个核细胞上CD80的表达降低,而三组间CD86和MHCⅡ的表达无明显差异。3.法舒地尔对EAMG大鼠淋巴结单个核细胞中细胞因子的影响用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞中的CD4+IFN-γ+(Thl)细胞、CD4+IL-4+(Th2)细胞和CD4+IL-17+(Thl7)细胞比例发现,法舒地尔治疗后Th1、Th2和Th17细胞比例未见明显变化。另外,用流式细胞术检测EAMG大鼠淋巴结单个核细胞中的TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子也未见明显差异。4.法舒地尔可抑制EAMG大鼠淋巴结单个核细胞中的Tfh细胞用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞中CD4+CXCR5+ICOS+细胞占CD4+细胞的比例,结果显示,与EAMG对照组及小剂量组相比,大剂量组Tfh细胞比例明显降低。5.法舒地尔可抑制EAMG大鼠淋巴结单个核细胞中的B细胞及脾脏生发中心的产生用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞中CD19+B细胞的比例,结果显示,与EAMG对照组及小剂量组相比,大剂量组CD19+B细胞的比例降低。对大鼠脾脏进行免疫荧光染色发现,大剂量组脾脏生发中心的数量明显少于EAMG组及小剂量组。结果提示法舒地尔减少CD19+B细胞,尤其是生发中心中的B细胞。6.法舒地尔可降低EAMG大鼠抗体的数量及亲和力用ELISA检测大鼠血清中的抗体数量,结果显示,与EAMG对照组相比,大剂量组抗R97-116抗体的数量明显减少,小剂量组抗体数量减少,但差异无统计学意义。硫氰酸盐洗脱法检测抗体亲和力发现,与EAMG组相比,法舒地尔治疗后小剂量组及大剂量组EAMG大鼠的R97-116抗体亲和力均降低,两治疗组之间无差异。结论：ROCK抑制剂法舒地尔缓解EAMG大鼠症状,下调淋巴结单个核细胞上的CD80分子,抑制Tfh细胞,减少CD19+B细胞,破坏生发中心反应,抑制抗体数量和亲和力。也就是说,ROCK抑制剂通过抑制体液免疫反应有效缓解EAMG症状。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R746.1

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