人脂肪来源干细胞的Ferumoxytol标记及移植治疗大鼠脑梗死的磁共振成像研究

发布时间：2019-01-08 21:18

【摘要】：脑血管病(cerebral vascular diseases,CVD)是一种常见的高致残致死率的临床疾病,其中脑梗死最为多见。目前,治疗脑梗死除了溶栓和抗血小板治疗外,尚没有更为有效的治疗措施。但由于溶栓治疗的严格时间窗限制及存在脑出血的风险,溶栓治疗并非脑梗死的常规治疗方法。因此,临床上大部分的脑缺血治疗方案为对症保守治疗,效果难以令人满意。干细胞是一类具有自我更新能力、高度未分化性和多向分化潜能的细胞,越来越多的证据表明,干细胞移植有望成为治疗脑血管病有前途的细胞替代性治疗策略,干细胞技术的发展,为治疗甚至治愈脑梗死提供了可能。多种干细胞如胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和神经干细胞(neural stem cells, NSCs)及骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)已经应用于脑梗死的替代治疗。脂肪干细胞(adipose.derived stem cells, ADSCs)由于取材容易,避免其他来源干细胞细胞移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题,是很好的种子来源,近年来已应用治疗脑梗死的研究中。干细胞移植治疗首先要解决如何示踪移植细胞的存活、迁移、定居、分化情况。MRI技术具有分辨率高、无侵袭件和高临床应用率等优点,能够很好显示经特定MRI对比剂标记的移植干细胞的分布、增殖及迁移等情况。选择合适的对比剂来标记干细胞,是进行移植干细胞磁共振活体示踪成像成功与否的关键。超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)微粒是一种MRI负性对比剂,标记移植细胞(细胞内标记或者细胞表面标记)能显著降低MRI下的T2WI和T2*WI信号,明显区分移植细胞和原位组织细胞,从而间接反映移植细胞的分布和迁移情况。以往广泛应用于临床的SPIO相继退市,极大地阻碍了干细胞活体示踪技术的发展。Ferumoxytol是一种新型SPIO,目前已获FDA批准进入临床,用于治疗成人慢性肾病所致的缺铁性贫血。本实验用Ferumoxytol体外标记hADSCs,在磁共振下体内外观察标记的hADSCs,监测hADSCs在脑内存活、增殖和迁移情况,分析对MCAO大鼠的神经功能评分改变的影响,评价Ferumoxytol标记1ADSCs经立体定向移植治疗大鼠脑梗死的可行性。第一部分人脂肪来源干细胞的分离、培养及鉴定目的：探索人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs) 的体外培养方法。方法：取脂肪抽吸术获得的脂肪抽吸物分离获得hADSCs,贴壁法扩增培养hADSCs,相差显微镜观察原代及不同传代细胞的生长形态变化,并进行细胞活力、增殖能力、细胞表型鉴定及多向分化潜能检测。结果：培养的BMSCs传代24小时后已有部分细胞贴壁,第7天细胞已达90%融合，至第3代可得纯化的hADSCs;细胞表面抗原CD13、CD44、CD90呈高表达,低表达CD34、CD45、CD 106; hADSCs在功能上具有成脂肪、成骨及成软骨潜能。结论：第3代hADSCs可作为理想细胞移植治疗的细胞来源。第二部分Ferumoxytol标记hADSCs及其生物学影响目的：明确新型超小超顺磁性氧化铁纳米微粒(USPIO) Ferumoxytol体外标记hADSCs所需的合适浓度和铁微粒在细胞中的代谢、存留情况,探讨Ferumoxytol标记hADSCs的可行性,为标记细胞的磁共振成像奠定基础。方法：首先从ferumoxytol-鱼精蛋白(ferumoxytol-protamine, PF)、ferumoxytol-肝素-鱼精蛋白(ferumoxytol-heparin-protamine,HPF)以及ferumoxytol-多聚赖氨酸(ferumoxytol-poly-L-lysine, F-PLL)复合物中选取最合适的标记物,并选定适合浓度；然后,对标记后]ADSCs的形态学、活力、表面抗原、增殖能力、凋亡和多向分化能力进行检测。结果：HPF对的hADSCs标记效果最佳；含铁量为50μg/ml的HPF标记hADSCs对细胞的生物学特性无影响。结论：最佳浓度HPF标记对hADSCs的生物学活性没有影响,可用于体内动物实验。第三部分Ferumoxytol标记hADSCs的体内外MR成像研究目的：应用MR成像技术观察Ferumoxytol标记后的hADSCs体外成像情况,并移植入正常SD大鼠脑内,初步评价MRI体内示踪Ferumoxytol标记hADSCs的可行性及探讨最佳的扫描方法。方法：对Ferumoxytol标记hADSCs进行离体试管及移植入正常大鼠脑内的MRI观察。结果：离体试管MRI各序列显示标记细胞不同程度的信号降低,其中ESWAN序列信号减低最明显；标记细胞移植入正常大鼠脑内后28天仍可在ESWAN序列上.显示为局部低信号。结论：MR成像技术能够对体外及活体移植的Ferumoxytol标记hADSCs进行活体示踪,以ESWAN序列最敏.感；标记hADSCs移植入正常大鼠脑内,28d内停留于注射位点,未见迁移。第四部分MCAO大鼠模型的建立目的：用线栓法制作SD大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,掌握模型制作方法。方法：选用健康、成年雄性清洁级SD大鼠,用线栓法堵塞大脑中动脉1.5h,再灌注后1 d Zea-Longa评分2-3分为成功模型。模型制造后1d、7d、14d、28d通过神经功能缺损严重程度评分(modified Neurological Severity Scores, mNSS)评分观察其行为学改变,同时行MRI检查了解各序列梗塞病灶变化情况,再灌注后28d断头取脑,进行HE染色观察梗塞情况。结果：技术未成熟时模型制备再灌注24小时内模型成功率为55%。各时间点NSS评分有明显差异,手术后NSS有所改善。成功模型MRI扫描可见大鼠梗死区脑组织T2WI示显著高信号。结论：技术成熟后,线栓法可制备稳定的MCAO大鼠模型,能作为脑梗死实验研究的模型。第五部分Ferumoxytol标记hADSCs移植治疗MCAO大鼠的MR活体示踪目的：干细胞移植入MCAO大鼠脑内后,使用MRI活体监测移植干细胞的存活、分布及迁移。方法：线栓法制作MCAO模型,实验动物共分5组：假手术组：仅分离结扎颈外动脉分支,不插入栓线；MCAO组：MCAO模型成功后不进行移植；PBS组：MCAO后同侧纹状体内PBS液：未标记组：MCAO后移植未经Ferumoxytol标记的hADSCs;磁标记组：MCAO后移植Ferumoxytol标记的hADSCs。移植成功后分别在1d、7d、14d、28d参照mNSS进行神经功能缺损评分,GE 3.0T磁共振扫描仪动态观察移植细胞的存活及迁移,将所得到的影像学检查结果与脑组织切片的HE染色及普鲁士蓝染色进行对照研究。结果：除移植后1天外,其余时间点未标记组和标记组大鼠的神经功能缺损均较MCAO组评分差异有显著性(P0.05)；磁共振检查结果显示移植后1天呈边界清晰的团块状类圆形低信号,随着时间的推移,T1WI移植位点低信号微弱,T2WI可见移植位点的低信号边界略显模糊,而在ESWAN序列仍清晰；磁标记组28天脑缺血边缘区(移植位点周围)可见大量、缺血灶内可见散在、同侧蛛网膜下腔可见零星少量蓝染细胞。结论：Ferumoxytol标记的hADSCs移植入缺血性脑梗死大鼠脑内后,磁共振成像在长达28天的活体监测过程中,均可明确显示移植干细胞的分布情况。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

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