滤泡辅助性T（Tfh）细胞在重症肌无力发病中的作用机制研究

发布时间：2019-01-17 20:18

【摘要】：重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是由乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,ACh R)抗体介导的神经肌肉接头处获得性自身免疫性疾病。目前普遍认为:胸腺在MG的发生、发展以及疾病的维持中扮演着重要的角色。80%的MG患者合并有胸腺异常,包括胸腺增生和胸腺瘤,此外,HE染色发现MG患者胸腺中有B细胞增生形成的异位生发中心(germinal centers,GCs)。滤泡辅助性T(T follicular helper,Tfh)细胞是CD4+T细胞的一个重要亚群,在B细胞成熟、抗体产生、GC形成中发挥着极其重要的作用。研究表明Tfh细胞及其相关的效应分子在多种自身免疫性疾病中发挥着重要作用,表现为数量增加或者功能异常。有研究显示MG患者外周血中Tfh细胞比例增加,但是MG患者胸腺中是否也有Tfh细胞比例的变化以及Tfh对胸腺B细胞的辅助及异位GC形成中的作用目前尚不清楚。因此,我们的目的是通过研究MG患者外周血和胸腺中的Tfh细胞比例的变化,及其与抗ACh R抗体水平之间的关系,以及Tfh和B细胞之间的相互作用,探索Tfh细胞在抗体产生、异位GC形成及MG发病中的作用。方法从唐都医院神经内科收集113例MG患者的外周血,其中眼肌型MG(Ocular MG,OMG)34例,全身型MG(Generalized MG,GMG)79例,同时收集20例年龄、性别相匹配的健康对照者(Healthy controls,HC)和9例单纯的胸腺瘤不合并MG(Non-MG-associated thymomas,NMG)患者为对照组。另外,我们还从唐都医院胸外科收集28例合并胸腺异常的MG患者的胸腺组织以及外周血,其中OMG 9例,GMG 19例。同时还收集8例单纯胸腺瘤患者的胸腺组织标本以及从西京医院心脏外科获得9例正常胸腺作为对照组。分别采用密度梯度离心和机械分离的方法从外周血和新鲜的胸腺组织中分离获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和胸腺细胞。采用流式细胞术的方法检测MG患者和对照组的外周血和胸腺组织中的Tfh和B细胞的比例;采用放免的方法检测患者血清和胸腺组织上清中抗ACh R抗体的滴度,并且分析其与Tfh和B细胞的比例的相关性;通过RT-PCR的方法检测PBMCs和胸腺组织中Tfh、Th1以及Th2相关转录因子Bcl-6、T-bet、以及GATA-3 m RNA的表达水平;分别采用了RT-PCR,Western Blotting以及ELISA的方法检测了PBMCs和胸腺组织中Tfh、Th1以及Th2相关细胞因子IL-21、IFN-γ以及IL-4 m RNA和蛋白的表达水平。为了进一步研究Tfh在ACh R抗体产生及MG病理过程中的作用,我们采用免疫磁珠分选的方法,从GMG患者和健康对照者的PBMCs中分选纯化Tfh和B细胞,单独或者共同培养7天后,检测培养上清中抗ACh R抗体滴度和IL-21水平;同时我们还采用活细胞工作站的方法,动态观察了Tfh和B细胞之间的相互作用。此外,我们还通过免疫荧光染色、共聚焦荧光显微镜观察MG患者胸腺组织中的异位GC以及Tfh与B细胞的共定位。另外,我还随访了28例胸腺切除后的MG患者,分析了他们术后疾病的转归情况,并且收集了3例术后复发的MG患者的骨髓,采用流式细胞术的方法检测了骨髓中ACh R特异性的长寿浆细胞的比例。结果MG患者外周血及胸腺组织中CD4+CXCR5+ICOS+T细胞(Tfh细胞)和B细胞的比例较对照组均显著增高,并且GMG患者显著高于OMG患者,同时GMG患者血清以及胸腺组织上清中的抗ACh R抗体滴度也显著高于OMG和对照组,但是OMG和对照组之间比较无差异;相关性分析提示:Tfh细胞的比例与患者QMG评分和抗ACh R抗体滴度水平均呈正相关;Tfh细胞相关的转录因子Bcl-6和细胞因子IL-21的表达在OMG和GMG患者的外周血以及胸腺中表达均显著高于对照组,此趋势在GMG患者组中更为明显,但是Th1和Th2细胞相关转录因子T-bet、GATA-3和细胞因子IFN-γ、IL-4的表达在各组之间没有差异;体外共培养的实验中发现:GMG患者外周血的B细胞单独、与自身的Tfh细胞或者与健康对照的Tfh细胞共同培养时,培养上清中均能检测到抗ACh R抗体,并且在GMG患者的B细胞与自身的Tfh细胞培养上清中ACh R抗体滴度显著高于其他组;同时,GMG患者Tfh细胞与自身的B细胞和GMG患者Tfh细胞与健康对照的B细胞培养的上清中有较高水平的IL-21,并且前者显著高于后者;活细胞工作站也动态观察了Tfh和B细胞相互作用的过程;激光共聚焦结果提示:MG患者胸腺组织中存在异位GC,并且异位GC内发现有CD4+CXCR5+Tfh的分布,同时观察到Tfh与B细胞在空间上有相互接触、相互作用的区域;对切除胸腺的MG患者随访结果显示:MG患者在术后1个月时,外周血中Tfh、B细胞以及抗ACh R抗体水平较术前降低,但是在疾病复发后又均升高,甚至超过术前的水平,并且发现胸腺切除术后复发的MG患者骨髓中存在ACh R特异性长寿浆细胞,而健康的对照者骨髓中几乎没有,差异具有统计学意义。结论我们的研究结果提示:MG患者外周血以及胸腺中的Tfh细胞可能参与了MG的病理过程。同时,MG患者胸腺中的Tfh细胞和B细胞之间的相互作用可能促进了异位GC的形成和抗ACh R抗体的产生,这可能是MG始动以及维持的主要原因。因此对Tfh细胞进行调控或特异性阻断Tfh-B细胞的相互作用有可能成为MG治疗的一个新靶点。此外,胸腺切除术后疾病复发的MG患者骨髓中检测出ACh R特异性长寿浆细胞,这些长寿浆细胞可能是ACh R抗体的另外一个来源,是其疾病复发的主要原因,对其进行干预有可能成为术后复发患者治疗的一个新靶点。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R746.1

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