马来酸桂哌齐特对大鼠缺血性脑损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2019-02-11 12:00

【摘要】：脑卒中是指发生于脑部血管、因血液循环障碍而造成脑组织损害的一组疾病,一般分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中(脑梗死),而后者约占脑血管疾病的80%。在世界范围内,由脑动脉闭塞导致的急性缺血性脑损伤是老龄人群脑卒中发病率高、死亡率高的主要原因。急性脑缺血发生后,氧化应激、炎症因子释放、兴奋性氨基酸释放、细胞内钙超载、线粒体功能障碍等一系列级联事件的发生将会导致神经元的大量死亡。深入研究并探索有效的神经保护药物一直是神经科学领域工作的重点和难点。马来酸桂哌齐特(cinepazide maleate,CM)作为哌嗪类钙离子通道阻滞剂,既往研究已表明其具有扩张血管和促进细胞代谢的双重作用,而且在最近的临床研究中还发现其具有与米屈肼相似的脑保护作用,然而其上述作用的相关机制却不甚清楚。因此,本课题以线栓法大鼠大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型为研究平台,深入研究马来酸桂哌齐特的脑保护作用及其可能的作用机制。第一部分CM对实验性脑缺血治疗效果的研究目的:研究CM对MCAO损伤Sprague-Dawley(SD)大鼠是否具有脑保护作用。方法:(1)CM最佳治疗剂量探索:选择健康雄性成年SD大鼠,通过线栓法建立mcao模型。按照术后2h神经功能评分(neurologicalbehaviorscores,nbs)差值≤3、体重(bodyweight,bw)差值≤20g、mri轴位扫描最大梗死面积百分比≤10%的标准进行配对,共分三个cm处理组(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)和一个生理盐水(normalsaline,ns)对照组,每组15只sd大鼠,分别给予腹腔注射相应剂量cm和ns。观察各组在mcao损伤7d后的sd大鼠nbs变化情况。(2)cm对实验性脑缺血治疗效果的验证:按(1)所述方法进行建模、配对,分为一个cm处理组(选用cm的最佳使用浓度)和一个ns对照组,每组15只符合条件的mcao模型大鼠,观察各组在mcao损伤后1d、3d、7d的sd大鼠死亡率、bw、nbs和7d的脑梗死体积,验证cm对mcao损伤大鼠的脑保护作用。结果:(1)10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg三个cm处理组术后7d(pod7)的神经行为功能恢复情况(nbs7d-nbs12h)均好于ns对照组,但只有20mg/kg组(2.05±0.19)与ns对照组(1.25±0.35)之间差异明显(p0.05);(2)cm虽不能降低总体死亡率,却能明显降pod1的死亡率(cm处理组:33.33%,ns对照组:85.71%;p0.05),促进术后神经行为功能的恢复(nbs7d-nbs12h)(cm处理组:2.00±0.24,ns对照组:1.19±0.31;p0.05),降低pod7的脑梗死体积百分比(cm处理组:24.72±4.36%,ns对照组:32.04±4.01%;p0.05),同时具有促进bw恢复的趋势(cm处理组:252.06±8.51g;ns对照组:245.09±8.77g)。结论:cm对mcao损伤sd大鼠具有脑保护作用,且剂量为20mg/kg时效果最明显。第二部分cm对缺血性脑损伤后细胞死亡类型的影响研究目的:验证mcao模型缺血脑组织中细胞焦亡的存在,研究cm脑神经保护作用与细胞不同死亡类型之间的关系。方法:mcao损伤后随机分为cm处理组(20mg/kg)和ns对照组,通过tunel染色法观察mcao后1、3、7d细胞凋亡的变化情况,通过tunel和il-1β免疫荧光双标法寻找焦亡细胞,并观察焦亡细胞数量的变化情况;通过westernblot检测caspase-1、caspase-3、il-1β等蛋白因子的变化情况,进一步探索cm对细胞凋亡和焦亡的影响。结果:(1)在cm处理组和ns对照组1、3、7d的脑组织切片中均发现tunel和il-1β免疫荧光双标的阳性细胞,验证了mcao模型缺血脑组织中细胞焦亡的存在;(2)与ns对照组相比,cm能明显降低1、3、7d各时间点脑组织切片中il-1β、tunel单标及两者双标的阳性细胞数,提示cm能减轻凋亡、焦亡及il-1β炎症因子的表达;(3)与ns对照组相比,cm能明显抑制caspase-1、caspase-3、il-1β蛋白水平的升高,进一步印证了cm对缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡和焦亡的抑制作用。结论:(1)验证了缺血脑组织内焦亡细胞的存在;(2)cm可通过抑制细胞凋亡和焦亡发挥脑保护作用。第三部分cm改善缺血性脑损伤氧化还原状态失衡作用的研究目的:研究cm是否通过抗氧化作用保护mcao损伤的脑组织。方法:mcao建模成功后随机分为cm处理组(20mg/kg)和ns对照组,7d后取梗死区脑组织,提取组织匀浆液,分别检测活性氧簇(ros)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)、丙二醛(malondialdehyde,mda)、还原型谷胱甘肽(glutathione,gsh)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)等因子的浓度变化。为尽可能减少标本差异带来的实验误差,对每只sd大鼠的健侧及患侧均进行检测,结果分析时采用“患侧值-健侧值”的差值统一表示。结果:(1)与ns对照组相比,cm能显著提升细胞总抗氧化能力:明显提高sod水平(cm处理组:5.83±7.38u/mgpro,ns对照组:-3.41±6.15u/mgpro,p0.05),降低ros水平(cm处理组:26.90±36.49u/mgpro,ns对照组:65.68±33.87u/mgpro,p0.05);(2)与ns对照组相比,cm能保护谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPX)的酶活性,减轻细胞膜氧化应激损伤:明显降低谷胱甘肽过氧化物酶(GPX酶)底物—GSH的水平(CM处理组:-1.45±1.14μmol/mgpro;NS对照组:0.29±1.81μmol/mgpro,P0.05),降低MDA水平(CM处理组:-0.13±0.19μmol/mgpro;NS对照组:0.24±0.46μmol/mgpro,P0.05);(3)与NS对照组相比,CM能减轻受损脑细胞的破裂:CM处理后,梗死区脑组织匀浆液中的LDH水平明显升高(CM处理组:2.43±9.18U/gprot,NS对照组:-10.70±14.98U/gprot,P0.05)。结论:CM能明显提高细胞抗氧化能力,可通过改善脑缺血损伤后氧化还原状态失衡保护神经细胞。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743
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本文编号：2419712