KCNQ钾通道在帕金森病黑质多巴胺能神经元损伤中的作用研究

发布时间：2019-02-13 13:59

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的神经系统退行性疾病之一,中老年人的发病率较高,被称为威胁中老年人的“第三杀手”疾病。目前,我国已成为全球PD患者人数最多的国家,无论是从家庭的角度还是社会的角度,PD已经成为影响市民生活质量、家庭健康和社会经济迅速发展的重大社会性问题。PD最主要的病理学特征是中脑黑质致密带(substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性丢失,纹状体(striatum,Str)内代谢产生的DA含量减少,导致PD的一系列相关症状,尤其是运动症状,如静止性震颤、肌僵直、运动不能及姿势反射障碍。很多病理学机制都被证明与PD的发病相关,如:氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍、铁沉积毒性、蛋白异常聚集和细胞凋亡等。诸多的病理学机制使得PD的防治极其复杂,且现行治疗PD的药物副作用不可忽略,因此寻求新的有效治疗的靶点具有重要的意义。近年来有研究表明钾离子通道功能异常与PD的发病密切相关,PD因而也被称为“离子通道病”。Kv7/KCNQ/M通道(亦称KCNQ通道)是电压依赖型钾离子通道,在基底神经节广泛分布,其中免疫组化染色显示KCNQ4亚型在SNc表达丰富。本室的前期研究首次在SNc区DA能神经元中记录到KCNQ电流,并证实利用KCNQ通道特异性阻断剂10,10二(4-吡啶甲基)-9(10H)-蒽酮(10,10-bis(2-fluoro-4-pyridinylmethyl)-9(10H)-anthracenone,XE991)能够显著抑制KCNQ电流,增强DA能神经元的兴奋性,提高自发放电频率和簇状放电,从而增加Str内DA的释放。然而,以上研究主要关注了正常生理情况下KCNQ通道的功能,并未阐明在PD发病过程中KCNQ通道的生物学效应。因此,本研究旨在探讨KCNQ通道在PD的DA能神经元损伤中的调制作用。本实验通过制备6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的PD大鼠模型,利用免疫组织化学和免疫印迹技术,观察XE991侧脑室给药后对6-OHDA诱导的黑质(substantia nigra,SN)中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元数量、TH蛋白表达和Str内TH阳性神经纤维数量的影响;利用高效液相色谱电化学检测(high performance liquid chromatography,HPLC)法观察Str内DA及其代谢产物含量的变化;通过阿朴吗啡(apomorphine,APO)诱导的旋转行为、旷场实验、平衡木实验及握力实验,检测XE991对PD模型大鼠运动速度、平衡能力、运动协调能力和肌强直状况方面的影响;进一步在侧脑室同时给予KCNQ通道开放剂Retigabine,再次观察相关指标的变化。结果如下:1.通过Western blots检测,在正常大鼠SNc区域中,KCNQ通道第4亚基——KCNQ4表达丰富。2.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中,损毁侧SN区TH蛋白表达水平减少为正常对照组的12.5%,与正常对照组相比,差异有极显著性(P0.001)。侧脑室分别连续注射XE991(1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L)21天后,5μmol/L和10μmol/L XE991处理组可以拮抗6-OHDA造成的TH蛋白表达降低,与6-OHDA组相比,差异有显著性(P0.05,P0.01)。3.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中,损毁侧SN区TH免疫阳性细胞数量下降了83.3%,与正常对照组相比,差异有极显著性(P0.001)。侧脑室连续21天注射10μmol/L XE991后,TH免疫阳性细胞数量恢复至正常对照组的45.6%,与6-OHDA组比较,差异有极显著性(P0.001)。4.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中,损毁侧Str内DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid,HVA)的含量均降低,与正常对照组大鼠相比分别降低84.5%、53.2%和53.6%,差异有极显著性(P0.001)。侧脑室连续21天注射10μmol/L XE991后,Str内DA、DOPAC和HVA含量与6-OHDA组相比分别升高,差异有显著性(PDA0.01,PDOPAC0.001,PHVA0.01)。5.6-OHDA处理组大鼠与正常对照组相比Str内TH神经末梢数量明显减少。侧脑室连续21天注射10μmol/L XE991后,TH阳性神经末梢数量明显增加。6.XE991对PD大鼠运动障碍有明显的改善作用。在APO诱导的PD大鼠旋转行为中,6-OHDA组大鼠的旋转圈数明显高于正常对照组,差异有极显著性(P0.001);10μmol/L XE991处理组与6-OHDA组大鼠相比,旋转圈数明显减少(P0.001)。在旷场实验中,6-OHDA组大鼠在旷场中平均运动速度与正常对照组大鼠相比速度较慢,差异有显著性(P0.05);侧脑室给予XE991(10μmol/L)处理21天之后,平均运动速度与6-OHDA组大鼠相比较快,运动缓慢症状有明显改善,差异有显著性(P0.05)。在平衡木实验中,6-OHDA组大鼠在平衡木上的评分与正常对照组大鼠相比较低,平衡能力与运动协调能力明显下降,差异有显著性(P0.001);XE991处理组大鼠平衡木上的评分与6-OHDA组大鼠相比较高,平衡能力与运动协调能力有明显改善,差异有显著性(P0.05)。在握力强度实验中,6-OHDA组大鼠在钢丝上悬挂时间与正常对照组大鼠相比有明显的增加,肌强直情况严重,差异有显著性(P0.01);与6-OHDA处理组相比,XE991处理组大鼠肌强直情况明显改善(P0.05)。7.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中,损毁侧SN区TH蛋白表达减少,Str内DA、DOPAC和HVA的含量降低,大鼠出现运动缓慢、肌强直症状及平衡能力、运动协调能力下降,XE991处理组大鼠上述指标明显改善;侧脑室同时注射KCNQ钾通道开放剂Retigabine连续21天可以完全拮抗XE991的神经保护作用。以上结果表明,XE991对6-OHDA诱导的PD模型大鼠SN区DA能神经损伤具有保护作用,可以增加SN区TH蛋白水平的表达及TH免疫阳性细胞数目,提高Str区DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量,从而改善SN-Str系统的功能,并有效缓解PD模型大鼠的运动障碍。进一步实验结果表明XE991的上述保护作用是通过抑制KCNQ钾通道来实现的,KCNQ通道特异性开放剂Retigabine可以将XE991的保护作用完全阻断。本实验结果为KCNQ钾通道参与PD提供了新的理论依据,并为PD的药物防治提供新的策略。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5

【参考文献】