可转导的PR结构域对高级别脑膜瘤治疗作用的研究

发布时间：2019-03-07 16:24

【摘要】：一、目的： RIZ1基因定位于人染色体1p36(1)。RIZ基因编码两种蛋白，即RIZ1和RIZ2。RIZ1氨基末端比RIZ2多一个PR结构域。 RIZ1具有组蛋白甲基转移酶活性，可以通过促进组蛋白H3上的赖氨酸甲基化(2-4)。在乳腺癌、直肠癌和肝癌细胞株中上调RIZ1的表达，可以发现肿瘤增殖明显减缓(4-8)。在前面的试验中，我们应用组织芯片检测RIZ1在脑膜瘤中的表达，发现RIZ1在恶性脑膜瘤中表达甚少。重要的是，在体外试验中，恶性脑膜瘤IOMM-LEE细胞株中过表达RIZ1可以使其生长受到显著抑制，并出现G2/M期细胞周期阻滞；RIZ1蛋白在恶性脑膜瘤细胞中的表达与c-Myc呈负关联表达，在脑膜瘤细胞株中过表达RIZ1，可以下调c-Myc的表达，上述研究结果已经发表于杂志《Oncogene》(9)。根据以上研究成果，RIZ1表达两种蛋白RIZ1和RIZ2，其区别是RIZ1比RIZ2氨基末端多了200个氨基酸（即PR-domain），其余序列相同。RIZ1对于恶性脑膜瘤具有肿瘤抑制作用，那么PR domain是否能够单独产生这种肿瘤抑制作用？如果能够起作用，那么对于不同级别脑膜瘤细胞作用效果是否一样？可能的机制是什么？我们在本实验中对这一问题进行了研究与陈述。二、方法：首先我们利用不同级别脑膜瘤手术切除标本培养脑膜瘤原代细胞，并进行脑膜瘤原代细胞的鉴定及RIZ1的表达水平的检测，然后，我们利用HIV-TAT蛋白转导系统，此系统可以将目的蛋白转导入目的细胞内，并发挥所连接的目的蛋白的生物学作用，而TAT蛋白本身对于细胞没有毒性作用，，将TAT蛋白作用脑膜瘤原代细胞后，我们检测了不同给药浓度与给药时间的脑膜瘤原代细胞增殖及凋亡情况，在抑癌机制研究中，我们首先注意到RIZ1是甲基化转移酶家族8（KMT8）成员，它可以通过甲基化组蛋白H3第九位赖氨酸来调控下游相关分子的表达。在其他的肿瘤中，可以观察到1位/2位/3位的赖氨酸甲基化，我们通过表达谱芯片及甲基化分子靶标的检测探究TAT-PR domain蛋白肿瘤抑制活性的可能分子机制。最后我们在脑膜瘤手术切除标本中通过免疫组化方法检测RIZ1表达量是否真实存在差异趋势。三、结果：结果发现，在脑膜瘤原代细胞中，RIZ1随脑膜瘤级别的升高而降低，癌基因c-Myc随脑膜瘤级别的升高而表达量增高，TAT-PR domain能够使高级别脑膜瘤原代细胞增殖受到明显抑制，并且促进高级别脑膜瘤原代细胞的凋亡，在本实验中我们观察到WHOIII级脑膜瘤原代细胞蛋白处理组出现：1、H3K91位及2位的甲基化，2、c-Myc表达水平降低。基因表达芯片中我们绘制了蛋白处理后随时间改变全基因表达调控图谱，发现数个与肿瘤增殖，细胞周期相关的分子表达量发生改变。在脑膜瘤手术切除标本中，虽然标本量不多，但是仍可以观察到RIZ1随脑膜瘤级别升高而表达量下降的趋势。四、结论： TAT-PR domain蛋白能够使高级别脑膜瘤原代细胞增殖受到明显抑制，并且促进细胞的凋亡，这种肿瘤抑制效应在在体实验中也再一次被验证。这种肿瘤抑制作用可能是建立在高级别脑膜瘤中低表达RIZ1的基础之上。这种肿瘤抑制效应可能是通过PR-domain的甲基化转移酶活性调节下游c-Myc等肿瘤增殖凋亡相关分子而实现的。本实验共分为八个部分：第一部分：脑膜瘤原代细胞的培养。第二部分：RIZ1在不同级别脑膜瘤原代细胞中的表达研究。第三部分：可转导PR domain蛋白的构建。第四部分：PR对脑膜瘤原代细胞增殖和凋亡的影响。第五部分：PR domain经H3K9甲基化途径影响脑膜瘤原代细胞增殖凋亡的研究。第六部分：全基因谱表达芯片探讨PR domain的下游作用分子。第七部分：不同级别脑膜瘤手术切除标本验证RIZ1表达量改变。第一部分、脑膜瘤原代细胞的培养 1、目的：培养不同级别的脑膜瘤原代细胞，为后续的实验提供实验的载体。 2、方法：手术切除脑膜瘤后，取坏死较少，结构较完整的瘤体部分，使用不含血清的DMEM冰盒迅速转运，在30分钟内\是原代培养操作，使用不含血清的PBS缓冲液洗去肿瘤组织块表面的血液及杂质，在体视显微镜下，使用显微手术器械去除瘤体中血管及坏死组织，放置于少量PBS中，于3.5cm培养皿冰上进行剪碎操作，剪至1×1mm左右，加入与瘤体体积相当的胰蛋白酶，及少量DNA酶，将组织块置于37摄氏度孵箱中进行消化，原代细胞的消化总时间为30分钟，并且每五分钟需要震荡一次培养皿。消化完成后，使用2倍体积的含10%FBS的血清培养基中和胰酶，吹打后，分别经70微米和40微米细胞滤网过滤，将获得的细胞以900rpm/min的转速离心5分钟，重悬后，使用细胞计数仪计数，以5×106/ml的细胞浓度种于10cm培养皿中，37摄氏度，5%CO2浓度进行培养，每2日换液，当细胞达到80%融合度时，0.125%胰酶消化后进行传代操作。 3、结果：经前期标本采集，原代细胞培养，我们获得了4例脑膜瘤原代细胞，按2007WHO分级标准，1级脑膜瘤1例，2级脑膜瘤2例，3级脑膜瘤1例，4例原代细胞均生长旺盛，脑膜瘤形态多为双极或多级的内皮细胞形态，良性脑膜瘤多传至第10代，随代数的增加，细胞的胞体逐渐增大，形态不规则，增殖速度明显减慢，而恶性脑膜瘤细胞可增殖更多代，我们取3-5代的原代细胞用于进行后续的实验。 4、结论：经原代培养，我们获得1级脑膜瘤原代细胞1例，2级脑膜瘤原代细胞2例，3级脑膜瘤原代细胞1例。第二部分、RIZ1在不同级别脑膜瘤原代细胞中的表达研究 1、目的：检测4例脑膜瘤原代细胞中内源性RIZ1的表达量是否存在差异。 2、方法：首先，为了确定RIZ1在细胞中的定位，以及验证所使用RIZ1抗体的特异性。我们进行了RIZ1抗体鉴定实验，即首先利用RIZ1全长cDNA质粒转染工具细胞293T，使RIZ1瞬时表达量增加，RIZ1免疫荧光检测其具体细胞内定位。 4例脑膜瘤原代细胞培养至第三代，采用2种方法，即免疫荧光与免疫印记，检测4例原代细胞中RIZ1与c-Myc的表达量改变。 3、结果：RIZ1质粒转染实验中，我们发现RIZ1蛋白主要定位于细胞核，免疫荧光及蛋白印迹的检测结果发现，随脑膜瘤级别的升高，RIZ1的表达量下降，c-Myc的表达量上升，在3级脑膜瘤中RIZ1缺失表达。 4、结论：在4例脑膜瘤原代细胞中，RIZ1蛋白随脑膜瘤级别的升高而表达下降，c-Myc与其表达趋势相反。第三部分、可转导PR domain蛋白的构建 1、目的：为了验证PR domain对于脑膜瘤细胞是否单独具有抗肿瘤作用，我们需构建可穿膜的PR domain蛋白 2、方法：我们选用TAT蛋白转导系统将我们所需要的目的蛋白转入目的细胞中。首先经PCR扩增和基因克隆技术，我们将PR domain单独扩增出来，并且经NcoI和EcoRI双酶切连接到pTAT-HA表达载体上，得到融合质粒，将质粒转化DE3感受态细菌，并将细菌大量扩增，并诱导表达目的蛋白，经蛋白纯化后得到所需的目的蛋白，蛋白凝胶电泳观察目的蛋白分子量与纯度，BCA定量目的蛋白的浓度，冻存与-80℃。 3、结果：经质粒构建与蛋白纯化步奏，我们获得了所需的目的蛋白，经蛋白电泳，我们观察到目的蛋白分子量约32KD. 4、结论：我们将PR domain成功连接于TAT蛋白转导系统中。第四部分、PR对脑膜瘤原代细胞增殖和凋亡的影响 1、目的：验证可转导的PR domain对于脑膜瘤原代细胞是否具有抗肿瘤作用。 2、方法：首先我们以0.2μM的蛋白浓度处理脑膜瘤原代细胞2小时，行HA-tag免疫荧光染色，验证转导蛋白在细胞的定位情况，在绘制增殖曲线试验中，我们选取了5种蛋白浓度（0、0.05、0.1、0.2、0.4μM）对4例原代细胞进行处理，绘制6天的生长曲线，在绘制生长曲线同时，我们对各组细胞进行了增殖靶标ki67和PCNA的免疫荧光检测，在凋亡试验中，我们用0.4μM的给药浓度处理脑膜瘤细胞，用流式细胞仪检测24小时的细胞凋亡比例。 3、结果：我们发现转导蛋白主要定位于脑膜瘤原代细胞的胞核，细胞增殖实验，细胞增殖靶标检测试验以及凋亡实验均得到类似的结果，即转导蛋白对于高级别脑膜瘤的作用效果，明显优于低级别脑膜瘤，在实验中我们发现了几个值得深入研究的现象：1、转导蛋白对于3级的脑膜瘤原代细胞的抗增殖促凋亡的作用效果最明显，而对1级的脑膜瘤无明显的抗肿瘤作用，对于2级脑膜瘤的作用介于两者之间。2、2例2级脑膜瘤原代细胞中，转导蛋白对于M12的作用效果优于M11，而前面的实验中我们发现M12的内源性RIZ1表达量明显低于M11。3、增殖靶标ki67与PCNA的表达水平支持四例脑膜瘤原代细胞增殖曲线的趋势。 4、结论：PR domain可单独对高级别脑膜瘤原代细胞产生抗肿瘤作用。第五部分、PR domain经H3K9甲基化途径影响脑膜瘤原代细胞增殖凋亡的研究 1、目的：在前面的试验中，我们发现可转导的PR domain蛋白对于高级别脑膜瘤细胞具有肿瘤抑制作用，而其作用机制有待进一步的研究，RIZ1属组蛋白甲基转移酶8的家族成员，它可以甲基化组蛋白H3的第九位赖氨酸，调节下游分子通路的相关分子表达，PR domain作为RIZ1抑癌作用的重要功能结构域是否具有甲基转移酶活性，需实验验证。 2、方法：使用0.4μM的蛋白给药浓度，处理3级的脑膜瘤原代细胞，处理时间分别为0小时，4小时和12小时，提取各组细胞的蛋白后，免疫印记实验检测甲基化组蛋白表达量的改变，即H3K9me1(组蛋白H3第九位赖氨酸发生一甲基化)，H3K9me2(发生二甲基化)，H3K9me3(发生三甲基化)。同时我们检测了随时间改变，c-Myc的表达量改变，以及内源性RIZ1的表达量改变。 3、结果：我们发现，随时间的发展，H3K9me1及H3K9me2的表达量明显升高，而c-Myc的表达量逐渐减低，RIZ1及H3K9me3的表达量无明显的变化趋势。 4、结论：试验中我们观察到随组蛋白H3第九位赖氨酸1位及2位甲基化量的增加，c-Myc的表达量逐渐下降，考虑存在如下的信号通路，即RIZ1的PR domain功能结构域自身或与其它分子协同促使H3K9发生1位及2位甲基化，甲基化的H3K9通过调节c-Myc的表达量进而调节相应下游分子的表达。最终引起对高级别脑膜瘤的肿瘤抑制作用。第六部分、全基因谱表达芯片探讨PR domain的下游作用分子 1、目的：在前一步中，我们发现PR domain能够通过组蛋白甲基转移酶活性促使下游分子c-Myc的表达改变，除此通路外，是否还有其他的调节途径，我们通过全基因谱表达芯片来进行研究。 2、方法：我们以0.4μM的蛋白浓度处理3级的脑膜瘤原代细胞，处理时间分别为0小时，4小时，12小时，24小时和48小时，同时设立的对照组给予等体积的PBS处理，镜下拍照后，提取总RNA，送检，行全基因表达谱检测。 3、结果：形态观察中我们发现与对照组相比，3级的脑膜瘤原代细胞形态由典型规则的多边形向菱形演变，而其细胞触角也有延长的现象，全基因表达谱结果发现，随时间的进展，发生改变的基因数目也进行性地增加，其中包含有抑癌基因及细胞周期蛋白表达量的改变。 4、结论：可转导的PR domain蛋白可能促使一系列的抑癌基因表达量的增加，以及细胞周期蛋白的变化，其中间过程可能是由组蛋白甲基转移酶活性介导实现的，是否存在其他的调节机制即通路，有待我们进一步的研究。第七部分、不同级别脑膜瘤手术切除标本验证RIZ1的表达量改变 1、目的：从前面的试验中我们得知，可转导的PR domain对于高级别脑膜瘤肿瘤抑制作用是建立在高级别脑膜瘤低表达RIZ1的基础上的，而在临床上，高级别脑膜瘤细胞是否存在RIZ1表达量降低的趋势呢？此问题我们在本部分实验中进行了研究。 2、方法：收集不同级别的脑膜瘤手术切除标本，免疫组化检测标本中RIZ1与c-Myc的表达量变化。 3、结果：我们发现随脑膜瘤级别的升高，RIZ1的表达有下降趋势，这与我们前期的研究结果不谋而合。 4、结论：高级别脑膜瘤中RIZ1低表达。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.45

【参考文献】