线粒体分裂蛋白抑制剂对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元保护作用及其机制研究

发布时间：2019-03-31 13:26

【摘要】：背景与目的癫痫(epilepsy, EP)是脑部神经元高度异常同步化放电所致的临床综合征，具有短暂性、刻板性、重复性和发作性的特点。长期和反复的癫痫发作不仅严重降低了患者的生活质量，而且还给患者家庭及社会均带来沉重的经济负担，因此明确癫痫的发病机制并为其治疗提供新的靶点具有重要的现实意义。线粒体是真核生物氧化磷酸化主要场所，，不仅肩负着为细胞活动提供能量的重要作用，还在细胞信号传导中发挥着重要作用：线粒体的功能状态可影响细胞内钙信号传导、ROS(Reactive Oxygen Species, ROS)产生和促凋亡因子释放，参与细胞核的信号交流并整合和放大细胞的凋亡信号，在细胞生长、衰老和凋亡等生理、病理过程中均具有关键作用，因此近年来线粒体成为了癫痫研究的新热点。线粒体分裂蛋白抑制剂(mitochondrial division inhibitor, Mdivi-1)是一种喹唑酮类衍生物，其抑制动力相关蛋白(dynamin-related protein1, Drp1)的作用是通过抑制三磷酸鸟苷酶(guanosine triphosphatase, GTPase)的活性发挥。最新的相关研究已经证实Mdivi-1通过抑制线粒体分裂增加对心肌缺血再灌注损伤和急性肾损伤中的细胞凋亡具有显著的保护作用。那么Mdivi-1对癫痫发作引起的海马神经元损伤是否具有神经保护作用？其具体机制是什么？而目前国内外尚未见有关研究。因此，本实验拟通过建议氯化锂-匹鲁卡品大鼠模型，通过观察Mdivi-1对大鼠行为学、海马神经元损伤和凋亡影响，以此探讨Mdivi-1对匹鲁卡品(pilocarpine, PILO)致痫大鼠海马神经元损伤中的作用，并通过凋亡相关物质细胞色素C (cytochrome C, Cyt C)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factors, AIF)和半胱天冬酶3(caspase-3)水平变化，初步探讨其可能机制。材料与方法 88只健康雄性6-8周SD大鼠，体重在200-250g左右,随机分为CON组、PILO组、PILO+DMSO组和PILO+Mdivi-1组四组，每组22只。所有SD大鼠腹腔注射氯化锂(127mg/kg)进行预处理，20h后腹腔注射匹鲁卡品(30mg/kg)，在注射匹鲁卡品前30min给予氢溴酸东莨菪碱(1mg/kg)皮下注射以拮抗匹鲁卡品的外周胆碱能反应。PILO+Mdivi-1组和PILO+DMSO组在注射匹鲁卡品前30min分别给予腹腔注射Mdivi-1(1.2mg/kg)和二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）(0.1%)。对照(CON)组用等体积的生理盐水代替匹鲁卡品。癫痫持续状态(statusepilepticus, SE)持续60min后腹腔注射地西泮(10mg/kg)终止发作。以Racine痫性发作分级标准为判定标准，达Ⅳ或Ⅴ级定为癫痫模型制作成功。分别记录各组大鼠致痫成功率及潜伏期。造模成功后各组一半大鼠在SE后72h麻醉后灌注取脑，采用尼氏染色法和TUNEL法检测神经元损伤和凋亡情况，剩余大鼠在SE后24h麻醉后断头取脑，分离出双侧海马，采用Western blot法检测Drp1、Cyt C、AIF和caspase-3表达水平，RT-PCR法检测Drp1mRNA水平。结果 1.行为学观察：CON组大鼠无痫性发作，PILO组、PILO+Mdivi-1组和PILO+DMSO组大鼠有痫性发作，最高可达Ⅳ-Ⅴ级，各组大鼠造模成功率和发作潜伏期之间差异均无统计学意义。 2.病理学检测：Nissl染色结果显示与CON组相比，PILO组、PILO+Mdivi-1组和PILO+DMSO组三组大鼠海马神经元出现明显损伤，神经元数目减少，差异有统计学意义；与PILO组相比，PILO+Mdivi-1组海马神经元数目增多，差异有统计学意义，PILO+DMSO组海马神经元数目减少，但无统计学意义。TUNEL法结果显示与CON组相比，PILO组、PILO+Mdivi-1组和PILO+DMSO组三组大鼠海马神经元凋亡数目增多，差异有统计学意义；与PILO组相比，PILO+Mdivi-1组海马神经元凋亡数目减少，差异有统计学意义，PILO+DMSO组海马神经元凋亡数目增多，差异无统计学意义。 3. Western blot结果：与CON组相比，PILO组、PILO+Mdivi-1组和PILO+DMSO组三组大鼠在SE后24h海马组织内Drp1水平显著升高，Cyt C释放、AIF移位和caspase-3激活明显增加，差异有统计学意义；与PILO组相比，PILO+Mdivi-1组Drp1水平降低，PILO+DMSO组Drp1水平升高，差异均无统计学意义； PILO+Mdivi-1组Cyt C释放、AIF移位和caspase-3激活减少，差异均有统计学意义，PILO+DMSO组Cyt C释放、AIF移位和caspase-3激活增多，差异均无统计学意义。 4. RT-PCR结果：与CON组相比，PILO组、PILO+Mdivi-1组和PILO+DMSO组三组大鼠在SE后24h海马组织内Drp1mRNA水平显著升高，差异有统计学意义；与PILO组相比，PILO+Mdivi-1组Drp1mRNA水平降低，PILO+DMSO组Drp1mRNA水平升高，差异均无统计学意义。结论 1. SE发作后海马神经元内Drp1及Drp1mRNA增加，证明线粒体分裂增加参与癫痫病理损伤过程； 2. Mdivi-1对癫痫大鼠海马神经元有神经保护作用，其机制可能与抑制Cyt C释放、AIF移位和caspase-3激活有关； 3.抑制线粒体分裂可成为抗癫痫治疗的新思路和方法。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

【参考文献】