HLA-DMA rs1063478位点多态性与胶质瘤易感性及mTOR通路与高级别胶质瘤预后的关系

发布时间：2019-04-01 19:25

【摘要】：第一部分HLA-DMA基因rs1063478位点多态性与胶质瘤基因环境的关系研究背景:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,目前的治疗理念是以手术治疗为主、放射治疗及化疗作为辅助治疗手段的综合治疗。但是,由于人脑胶质瘤生长部位的特殊性以及其侵润性生长的临床特点,治疗效果并不理想,胶质瘤的高复发率及高死亡率使其成为预后最差的肿瘤。毫无疑问,对于胶质瘤发病因素及发病机理的认识有助于胶质瘤的有效预防以及寻找最新的肿瘤靶向治疗措施,从而改善患者的预后。已经证实某些基因突变与胶质瘤发病风险的增高具有显著相关性。HLA-DMA与人免疫系统联系密切,很多恶性肿瘤都是由免疫监视障碍所引起,已经发现HLA-DMA基因与很多恶性肿瘤的发生有关,这些研究结果提示我们,HLA-DMA的基因突变及其多态性可能与胶质瘤的发生发展有关系,但是,这方面的研究目前未见报道。多种高剂量的电离辐射是目前唯一被证实的胶质瘤的环境危险因素,但是电离辐射暴露的人群中仅仅有很少数者最终发生了胶质瘤。环境因素和胶质瘤发病风险的关系以及环境因素是通过什么途径诱发了胶质瘤的发生?其机制仍然有待于进一步探讨。传统观点认为,基因-环境交互作用促成了基因突变的获得,从而推进了多阶段致癌。研究表明,基因—环境交互作用可能和胶质瘤相关,但是迄今为止还没有关于HLA-DMA基因多态性-环境因素交互作用与胶质瘤易感性关系方面的研究。为了发现中国汉族人群HLA-DMA基因多态性及其与环境的交互作用对胶质瘤发病风险的影响,我们应用单纯病例研究方法,探索了HLA-DMA rs1063478位点多态性及其与环境因素交互作用对胶质瘤易感性的影响,力求从一个侧面探究胶质瘤的发病机理。研究目的：1.归纳分析与胶质瘤发病风险相关的环境因素。2.检测两组受试者HLA-DMA基因rs1063478位点的多态基因型分布。3.研究HLA-DMA基因rs1063478位点多态性与胶质瘤发病风险的关系。4.探讨HLA-DMA基因rs1063478位点多态性-环境因素交互作用与胶质瘤发病风险的关系研究方法：1.收集两组受试者的基本信息,应用卡方检验探讨与胶质瘤发病风险相关的环境暴露因素。2.应用PCR-RFLP技术检测90例胶质瘤病人及110例健康人HLA-DMA基因rs1063478位点的多态基因型分布。3.检测两组病人基因型的分布与HWE(哈迪-温伯格平衡定律)的一致性。4.应用Logistic回归分析评估HLA-DMA基因rs1063478位点多态性与胶质瘤发病风险的关系。5.通过多因素回归分析研究HLA-DMA基因rs1063478位点多态性-环境因素交互作用与胶质瘤发病风险的关系。研究结果：1.与胶质瘤发病风险相关的基本因素分析我们统计了90例胶质瘤病人及110例健康人受试者在年龄、性别、是否具有吸烟史、是否具有饮酒史、是否具有胶质瘤家族史、是否具有化学毒素接触史以及是否具有电离辐射暴露史方面的信息,并对相关信息进行χ2检验,发现两组病人在年龄、性别、吸烟及饮酒史方面没有统计学差异(p0.05)；在胶质瘤家族史方面,病例组(10例,11.1%)明显高于对照组(1例,0.9%),差异具有统计学意义(p=0.002)；关于环境因素,与对照组相比(0.9%),病例组有10%的病人具有化学毒素接触史,差异具有统计学意义(p=0.003),由于放疗(4例)和职业暴露(9例),病例组共13例病人接触了电离辐射,两组病人遭受电离辐射的比例具有显著性差异(病例组14.4%,对照组1.8%,p=0.001)。表明胶质瘤家族史、化学毒素及电离辐射与胶质瘤发病风险有显著相关性。2. HLA-DMA基因rs1063478位点的多态基因型分布我们应用PCR-RFLP技术检测了90例胶质瘤病人及110例健康人HLA-DMA基因rs1063478位点的多态基因型分布,共检测出三种C/T多态基因型,分别为CC、CT及TT基因型,其中病例组CC基因型40例,CT基因型38例,TT基因型12例,CT+TT基因型共50例；对照组CC基因型68例,CT基因型36例,TT基因型6例,CT+TT基因型共42例。3.两组病人的基因型分布与HWE的一致性应用卡方检验计算两组病人的CC、CT以及TT等基因型分布频率情况,发现对照组基因型频率分布符合HWE平衡定律(χ2=0.1822,p=0.6695)病例组基因型分布也与HWE平衡相一致(χ2=0.3809,p=0.5371),提示两组病人的HLA-DMA基因rs1063478位点基因型分布具有很好的群体代表性。4. HLA-DMArs 1063478位点多态性与胶质瘤发病风险的关系通过单变量回归分析发现,TT突变纯合子基因型的频率,病例组高于对照组,胶质瘤的发病风险增加了3.40倍(OR=3.400,95% CI=1.184-9.764)。杂合子基因型CT可能是胶质瘤发病的风险因素,但是没有统计学意义上的显著关联(OR=1.794,95% CI=0.985-3.271)。CT+TT基因型比CC基因型更有胶质瘤发病风险,有统计学意义(OR=2.204,95% CI=1.149-3.566)。通过多元回归分析可以发现,在校正了年龄、性别、有无吸烟史、有无胶质瘤家族史、有无化学毒素及电离辐射接触史后,得出校正的OR,CT+TT基因型仍然增加了胶质瘤的发病风险,且具有统计学意义(校正OR=1.984,95％CI=1.084-3.630).5.HLA-DMA基因rs1063478位点多态性-环境因素交互作用与胶质瘤发病风险的关系9例有化学毒素接触史的胶质瘤病人中,有2例表现为纯合子CC基因型,有7例表现为CT+TT突变基因型,通过多因素回归分析,发现化学毒素虽是胶质瘤发病的风险因素,但是HLA.DMA基因rs1063478位点多态性与化学毒素没有交互作用(p=0.289,OR=3.093,95%CI=0.065.15.801)；13例有电离辐射暴露史的病人中,有2例表现为纯合子CC基因型,有11例表现为CT+TT突变基因型,通过多因素回归分析,发现HLA.DMA基因rs1063478位点多态性与电离辐射暴露具有交互作用,而且这种交互作用显著增加了胶质瘤的发病风险(p=0.033,OR=5.359,95％CI=1.13.25.797).结论：1.胶质瘤家族史、化学毒素及电离辐射与胶质瘤发病风险有显著相关性。2.HLA.DMA基因rs1063478位点多态性和胶质瘤的易感性具有显著相关性。3.HLA.DMA基因rs1063478位点多态性与电离辐射具有交互作用,这种交互作用使胶质瘤易感性显著增加。第二部分mTOR信号通路与高级别胶质瘤患者预后和增殖指数的相关性研究研究背景神经胶质瘤是成人中最常见的原发性脑内肿瘤,根据肿瘤的组织形态学特征胶质瘤分为四个等级,其中Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤属于高级别胶质瘤,其治疗原则为：以显微镜下最大程度的肿瘤手术切除为主,放射治疗以及化疗作为术后的辅助治疗措施。虽然经历了规范化的综合治疗,高级别胶质瘤的预后仍差,文献报道其生存期14周～2年,平均生存时间1年。按照高级别胶质瘤的WHO组织病理学分级判断患者预后,是目前最重要的、为广大神经外科医生广泛接受的手段,然而临床中也发现,病理学分级相同的个体间预后有较大差异,这与WHO胶质瘤分级的主观性有关系,同一病理标本不同的病理学专家很可能得出不同的诊断,而且胶质瘤存在异质性,神经外科医生留取的标本不一定能反映肿瘤的真实情况,综合上面两个因素,病理学专家根据组织形态学表现得出的诊断有时会出现偏差,根据病理诊断得出的胶质瘤分级也相应可能出现一些偏差,从而影响了病人预后的判断。Roversi G等认为高级别胶质瘤的预后常常是由其重要的生物标记决定的,探讨应用基于分子生物学的客观性指标推断肿瘤的临床分级及预后是非常有必要的。近年来,mTOR信号传导通路与肿瘤的发生和发展等的联系受到广泛的重视。有证据显示mTOR信号通路与胶质瘤的病理分级密切相关,既然mTOR信号通路与胶质瘤的病理分级密切相关,而胶质瘤的病理分级又与病人的预后有密切相关性,那么我们有理由相信mTOR信号通路相关靶蛋白的表达水平与高级别胶质瘤预后应该是相关的,目前这方面的研究很少,这正是本课题重点研究的内容之一。Ki-67基因是一种与增殖细胞相关的核抗原,因此,Ki-67可作为反映细胞增殖活性和细胞周期状态的一个指标。Ki-67已经被证明是多种恶性肿瘤预后评估的免疫组化生物标记,比如乳腺癌、胃癌等。研究表明,Ki-67的表达水平与脑胶质瘤细胞增殖活性及肿瘤恶性程度相关,那么Ki-67是否是高级别胶质瘤预后的独立因素哪?本课题将就此给予研究。目前,联合Ki-67与mTOR信号通路相关靶蛋白对高级别胶质瘤患者预后的研究鲜有报道,本研究通过对60例高级别胶质瘤的组织标本进行p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、Ki-67的免疫组化分析,并结合多种临床因素探讨了其与患者预后的关系。研究目的：1.检测p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K及Ki-67在不同级别高级别胶质瘤中的表达水平。2.探讨mTOR信号通路相关靶蛋白对高级别胶质瘤预后的影响。3.探讨Ki-67对不同级别高级别胶质瘤预后的影响。研究方法：1.根据病历资料及随访记录,记录所有研究对象的年龄、性别、术前Karnofsky评分、无进展生存期和生存期。2.取所有患者的肿瘤组织蜡块,切片行p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、Ki-67免疫组化染色,根据细胞染色强度和阳性细胞百分比进行综合分析,判定p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K及Ki-67的表达情况。3.应用Kaplan-Meier单因素分析法对包括p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、 Ki-67及病理级别等在内的12个预后影响因素进行生存分析,研究各预后影响因素对高级别胶质瘤预后的影响。4.对单因素分析中p0.05者进行COX回归多因素分析,进一步探讨相关因素对高级别胶质瘤预后的影响。研究结果：1.在胶质瘤Ⅲ级中,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和Ki-67的免疫组化染色呈中度阳性,在胶质瘤Ⅳ级中,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和Ki-67的免疫组化染色呈强阳性。p-AKT在胶质瘤Ⅲ级中的阳性率为79.2%(19/24),Ⅳ级胶质瘤中的阳性率为75.0%(27/36)；p-mTOR在胶质瘤Ⅲ级中的阳性率为75.0%(18/24),Ⅳ级胶质瘤中的阳性率为72.2%(26/36)；p-p70S6K在胶质瘤Ⅲ级中的阳性率为70.8%(17/24),Ⅳ级胶质瘤中的阳性率为80.5%(29/36)；Ki-67在胶质瘤Ⅲ级中的阳性率为70.8%(17/24),Ⅳ级胶质瘤中的阳性率为69.4%(25/36)。2.应用Kaplan-Meier单因素分析法对包括p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、 Ki-67及病理级别等在内的12个预后影响因素进行生存分析,发现p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K, Ki-67的表达情况与总生存率的关系具有统计学意义(p0.05)。3.对单因素分析中p0.05者进行COX回归多因素分析,患者p-AKT (low, high)及Ki-67 (low, high)与生存期均无相关性(P0.05);p-mTOR (low, high)及p-p70S6K (low, high)与生存期有相关性(p0.05)。4. p-mTOR阳性率与无进展生存期呈负相关(r=-0.838,p0.001),与生存期呈负相关(r=-0.777, P0.001). p-p70S6K阳性率与无进展生存期呈负相关(r=-0.509,p0.001),与生存期呈负相关(r=-0.531,p0.001)。5.2组p-mTOR、p-p70S6K的表达情况与无进展生存期和生存期的关系分别制作成Kaplan-Meier生存曲线,两者之间无进展生存期对比有显著性差异(p0.05),生存期对比差异有统计学意义(p0.05)。结论：1.mTOR信号通路中p-mTOR及p-p70S6K的表达水平与高级别胶质瘤患者预后密切相关,p-mTOF及p-p70S6K可作为对胶质瘤预后判断的客观性指标。2.Ki-67表达水平与胶质瘤患者预后无明显相关性。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

【参考文献】