稳定转染TDP-25对运动神经元电压门控钠通道的影响及N-乙酰半胱氨酸对钠通道的调节作用

发布时间：2019-04-09 12:35

【摘要】：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种慢性神经系统变性疾病,临床常表现为上、下运动神经元均受累的混合性瘫痪,该病呈进行性加重,最终导致死亡。本病的病因及发病机制尚不清楚,可能与遗传易感性、兴奋性毒性、氧化应激、营养代谢等多种因素相关。病理性蛋白聚合物,即泛素化包涵体,是ALS的主要特征,并且无论在家族性还是散发性ALS患者中都可以发现。TDP-25是在ALS患者中发现的TDP-43的C末端片段,分子量为25k Da。研究发现,TDP-25对神经元具有毒性作用,它可促进TDP-43包涵体的形成,对细胞造成损伤,导致神经元发生变性,但其具体致病机制尚不清楚。许多目前对神经元兴奋性的了解来源于对ALS相关m SOD1突变基因的研究,以往的研究发现,无论是散发性还是家族性ALS患者均表现出皮层的高兴奋性,因此我们推测两者存在相同的致病机制。细胞在代谢过程当中会产生一系列的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),正常情况下ROS的产生和清除之间处于一种平衡的状态而使细胞免受自由基的损伤。研究表明,突变TDP-43诱导了氧化应激,导致了ROS产生与清除之间的失衡及线粒体功能损伤,不同的氧自由基成分可直接增强细胞电压门控钠通道的活性,通过改变钠通道的特性提高细胞兴奋性。本实验室以前也已证明,在TDP-43细胞模型中,氧化应激及线粒体功能损伤同时存在,这种损伤可被一种安全有效的抗氧化剂双甲氧姜黄素改善。电压门控钠通道(Voltage-gated sodium channels,VGSCs或Navchannels)在动作电位的起始和传播中起到关键作用,这是形成细胞兴奋性的基础。因此本实验的首要目的是研究TDP-25对运动神经元细胞系电压门控钠通道的影响来评估其对神经元兴奋性的改变。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一种临床上呼吸道感染疗效较好的祛痰剂。其分子中的巯基(-SH)可作为H+供体直接发挥抗氧化作用,另外它还可以合成具有生物活性的谷胱甘肽,间接发挥抗氧化作用。另有研究表明,其具有较强的干扰自由基生成及清除已生成的活性氧自由基、抗细胞凋亡、调节基因表达及信号转导等作用。因此,本实验的第二目的是探讨突变组加入不同浓度NAC后,钠通道电生理特性是否发生改变。通过实验结果分析ALS可能的发病机制。目的:检测稳定转染TDP-25基因的运动神经元样细胞中电压门控钠通道的性质是否发生改变,以探讨TDP-25使运动神经元发生变性的可能机制;并进一步探讨N-乙酰半胱氨酸对电压门控钠离子通道功能的调节作用。方法:应用稳定转染TDP-25基因及空质粒(Empty vector)的两种细胞,该细胞系由本院神经病学实验室构建,依照NSC34细胞株的培养方法进行培养,将筛选所得细胞系进行培养、传代、种小片,将种好细胞的培养皿放入37℃、5%CO2培养箱中进行培养,24小时后取出,在全细胞膜片钳技术电压钳模式下,应用电压依赖性激活、快速失活及恢复、进入缓慢失活、缓慢失活的电压依赖性5种不同的刺激程序记录上述两种细胞钠电流并分析其性质改变;分别用20μM、50μM、80μM三种不同终浓度的NAC处理TDP-25细胞(NAC20组、NAC50组、NAC80组),24小时后取出,给予上述相同的刺激程序,再次记录三种不同浓度NAC的电压门控钠通道电流。结果:1电压依赖性激活:五组细胞的钠通道均存在电压依赖性,都是在刺激电压为-35m V时被激活,开始出现内向钠电流,之后随着刺激电压的增大,钠电流逐渐增大。Empty组(n=12)在-5m V时电流达到最大值,为-87.335±42.934p A/p F,TDP-25组(n=13)在刺激电压为-15m V时电流达峰值,为-118.563±38.207p A/p F。余三种细胞均在刺激电压为-10m V时电流达峰值,NAC20组(n=9)、NAC50组(n=13)和NAC80组(n=11)的电流峰值分别为-123.255±35.632p A/p F,-98.619±34.391p A/p F,-104.608±39.110p A/p F。五种细胞在电流达到峰值以后均逐渐减小。TDP-25组的半数激活电压V1/2(-30.717±1.494)较Empty组(-22.720±1.907)、NAC50组(-21.733±0.818)、NAC20组(-24.776±2.536)及NAC80组(-28.380±2.693)均提前,而Empty组、NAC50组则较低、高浓度加药组延后。尽管有数值上的差异,然而五种细胞的半数激活电压并没有明显统计学意义(P0.05)。TDP-25的斜率因子k(1.849±1.294)较Empty组(2.883±1.850,P0.05)减小,较NAC50组(3.667±0.663,P0.01)显著减小,而和NAC20组(2.416±2.202,P0.05)、NAC80组(2.157±1.154,P0.05)比较无明显统计学差异。2稳态快速失活:在预刺激电压为-100~-80m V时五种细胞的电压门控钠通道电流大小比较恒定,随着刺激电压的改变,钠电流不发生大的改变。在电压为-80~-10m V之间,随着刺激电压的增大,钠电流逐渐减小直至消失。五种细胞的半数失活电压V1/2、斜率因子k均无明显统计学差异(P0.05)。3快速失活后的恢复:TDP-25组的恢复时间常数(n=15τ=5.252±1.574)较NAC50组(n=13τ=6.863±1.827,P0.05)减小,较Empty组(n=18τ=7.238±2.104,P0.01)显著减小。然而,TDP-25组与低(n=12τ=5.567±1.756,P0.05)、高(n=18τ=5.826±2.215,P0.05)浓度NAC加药组相比无明显统计学差异。4进入缓慢失活:NAC50组细胞进入缓慢失活状态后钠通道的可用部分(n=10 0.355±0.178)明显小于TDP-25组(n=13 0.576±0.157,P0.05)、Empty组(n=9 0.529±0.187,P0.05)、NAC20组(n=12 0.522±0.200,P0.05)及NAC80组(n=10 0.513±0.159,P0.05)。而后四组细胞进入缓慢失活状态的比例相似,无明显统计学差异(P0.05)。5电压依赖性缓慢失活:NAC50组(n=12)的I/Imax值在条件电压为-50~-10m V之间明显小于其他四组细胞(P0.05)。TDP-25组的半数失活电压(n=11 V1/2=-16.580±0.658)较Empty组(n=9 V1/2=-24.113±0.668,P0.05)和NAC50组(n=8 V1/2=-40.763±1.081,P0.001)明显延后,有统计学意义。NAC80组的斜率因子k(n=10 k=15.466±2.235)较其他四组细胞增大(P0.05)。结论:1稳定表达突变TDP-25的运动神经元,电压门控钠离子通道快速失活的恢复快于对照组神经元,提示TDP-25可使运动神经元快速失活后能够较快的进入备用状态,减小动作电位间的绝对不应期时间,快速爆发动作电位,增加运动神经元的兴奋性。2 50μmol/L的NAC是一种有效的自由基清除剂,可显著延长TDP-25所致的电压门控钠离子通道快速失活后恢复的时间,同时可以加快运动神经元进入缓慢失活,提示适量的清除氧自由基,可有效的改善电压门控钠离子通道快速失活和缓慢失活功能,有助于延长绝对不应期,减少动作电位的频率。3有效的(50μmol/LNAC)清除氧自由基,可改善TDP-25所致的运动神经元电压门控钠离子通道的功能异常,提示氧化应激是运动神经元变性的重要机制之一。4过少(20μmol/L NAC)或者过多(80μmol/L NAC)的清除氧自由基并不能恢复TDP-25所致的运动神经元电压门控钠离子通道的功能异常,提示维持正常细胞功能需要适量的氧自由基。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R744.8

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