抑制AMPK活性对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护研究

发布时间：2019-04-10 06:56

【摘要】：研究目的：1、建立局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠模型,检测缺血侧脑组织中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)活性的变化,探讨抑制AMPK活性在脑缺血再灌注损伤中的意义；2、以脑组织中的星形胶质细胞和小胶质细胞为研究对象,观察局灶性脑缺血再灌注损伤后缺血侧脑组织中二者的变化,探讨抑制AMPK活性对星形胶质细胞和小胶质细胞的影响,初步了解抑制AMPK活性对于神经炎症损伤及其上游NFκB信号通路的影响；3、以细胞凋亡为切入点,观察局灶性脑缺血再灌注损伤后缺血侧脑组织中神经元细胞凋亡的情况,探讨抑制AMPK活性对神经元细胞凋亡的影响及机制。研究方法：1、将成年健康雄性昆明小鼠按照随机数字表法随机分为三组：假手术组、盐水对照组(脑缺血再灌注损伤模型组)、药物干预组(Compound C给药组)。制作小鼠MCAO/R模型,缺血1小时,再灌注24小时。药物干预组在造模过程中,插入线栓时立即腹腔注射Compound C 20mg/kg,盐水对照组在相同时间点给予等量生理盐水腹腔注射,而假手术组则不给予任何药物。应用Western Blot方法检测缺血侧脑组织中磷酸化AMPK (pAMPK)的蛋白表达水平,神经功能缺损评分评价小鼠神经功能缺损症状,氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察脑梗死体积。2、造模、动物分组及给药方式同前,应用免疫组化方法观察缺血侧脑组织中星形胶质细胞特异性标志物GFAP和小胶质细胞特异性标志物Ibal的阳性细胞表达情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测缺血侧脑组织中Cx43 mRNA表达,ELISA方法测定缺血侧脑组织中TNFα和IL-1β的含量,Western Blot方法检测缺血侧脑组织中iNOS和NFκB/p65蛋白水平表达；3、造模、动物分组及给药方式同前,应用TUNEL染色观察缺血侧脑组织中神经元细胞凋亡情况,应用免疫组化染色观察缺血侧脑组织中凋亡诱导因子AIF阳性细胞表达,Western Blot方法检测缺血侧脑组织细胞胞浆中细胞色素C (Cyt. C)的蛋白表达。研究结果：1、①假手术组小鼠脑组织中有少量pAMPK蛋白表达(皮质0.70±0.197,海马0.69±0.228),盐水对照组(皮质1.41±0.322,海马1.51±0.418)和假手术组相比,pAMPK蛋白表达明显增加,差异有显著统计学意义(P0.01)；给予20mg/kg Compound C干预后,可显著抑制pAMPK蛋白水平(皮质0.93±0.229,海马0.96±0.378),差异有统计学意义(皮质中：P0.01；海马中：P0.05)。：,②假手术组小鼠神经功能缺损评分为0分,盐水对照组小鼠神经功能缺损评分为(2.63±0.52)分,药物干预组小鼠神经功能缺损评分为(1.88±0.64)分,药物干预组小鼠神经功能缺损评分与盐水对照组小鼠比较显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。③假手术组小鼠无脑梗死灶,盐水对照组和药物干预组小鼠脑梗死体积比分别为(49.57±9.71)%与(24.07±7.74)%。与盐水对照组比较,药物干预组小鼠脑梗死体积显著缩小(P0.01)。2、①假手术组小鼠海马区GFAP阳性细胞数为(4.90±1.74)个/HP；盐水对照组小鼠缺血侧脑组织海马区GFAP阳性细胞数为(12.56±1.58)个/HP,显著高于假手术组(P0.01)；药物干预组小鼠缺血侧脑组织海马区GFAP阳性细胞数为(9.27±0.61)个/HP,与盐水对照组比较表达明显减少(P0.05)。②假手术组Cx43 mRNA相对表达为(0.38±0.06),盐水对照组Cx43 mRNA相对表达为(0.17±0.09),显著低于假手术组(P0.05)；药物干预组Cx43 mRNA相对表达为(0.35±0.09),与盐水对照组比较表达显著增加(P0.05)。③假手术组小鼠大脑皮质区Iba1阳性细胞数为(5.97±1.27)个/HP,盐水对照组小鼠缺血侧大脑皮质区Iba1阳性细胞数为(11.36±1.80)个/HP,较假手术组明显增多(P0.05)；药物干预组小鼠大脑皮质区Iba1阳性细胞数为(7.60±1.62)个/HP,较盐水对照组显著减少(P0.05)。④假手术组小鼠脑组织有少量TNF-α [(249.62 ± 48.37) pg/mg]、IL-1∞ [ (107.41 ±11.77) pg/mg]表达,盐水对照组小鼠缺血侧脑组织TNF-α [(442.92±97.59) pg/mg]、IL-1β [(209.09±24.69) pg/mg]含量较假手术组显著升高(P0.01)。和盐水对照组比较,药物干预组小鼠缺血侧脑组织TNF-α [(290.60±61.40) pg/mg]、IL-1β[(142.61±20.60) pg/mg]含量显著降低(P0.01)。⑤假手术组小鼠大脑皮层中有少量iNOS蛋白表达,为(0.85±0.32),盐水对照组小鼠缺血侧脑组织皮层中iNOS蛋白表达显著升高(P0.05),为(1.33±0.36),药物干预组小鼠缺血侧脑组织皮层中iNOS蛋白表达受抑制,为(0.96±0.31),较盐水对照组小鼠明显减少(P0.05)。⑥假手术组小鼠脑组织胞核内有少量NF κ B/p65蛋白表达(皮质0.72±0.243,海马0.73±0.304),盐水对照组小鼠缺血侧脑组织胞核内NF κ B/p65蛋白表达(皮质1.42±0.370,海马1.28±0.247)明显增加,差异有显著统计学意义(P0.01)；药物干预组小鼠缺血侧脑组织胞核内NFκ B/p65蛋白表达(皮质0.84±0.126,海马0.95±0.146)显著减少(皮质中P0.01,海马中P0.05)。3、①假手术组小鼠脑组织未见TUNEL染色阳性细胞,盐水对照组皮质区TUNEL阳性细胞数(81.00±12.21)个/HP、海马区TUNEL阳性细胞数(56.00±5.29)个/HP,均较假手术组明显增多(P0.05)；药物干预组皮质区TUNEL阳性细胞数(58.86±9.65)个/HP、海马区TUNEL阳性细胞数(43.33±3.79)个/HP,均较盐水对照组明显减少(P0.05)。②假手术组皮质区未见AIF阳性细胞表达,海马区见数个AIF阳性细胞；盐水对照组皮质区AIF阳性细胞数(46.70±3.45)个/HP、海马区AIF阳性细胞数(17.35±3.67)个/HP,均较假手术组显著增多(P0.05)；药物干预组皮质区AIF阳性细胞数(32.16±2.35)个/HP、海马区AIF阳性细胞数(13.17±3.91)个/HP,较盐水对照组均显著减少(P0.05)。③假手术组小鼠脑组织胞浆中有少量Cyt.C蛋白表达(皮质0.50±0.278,海马0.51±0.257)；盐水对照组(皮质1.46±0.322,海马1.61±0.441)和假手术组相比,缺血侧脑组织胞浆中Cyt.C蛋白表达明显增加,差异有显著统计学意义(P0.01)；药物干预组缺血侧脑组织胞浆中Cyt.C的蛋白水平(皮质1.02±0.174,海马0.92±0.229),与盐水对照组相比明显减少,差异有统计学意义(皮质：P0.05；海马：P0.01)。研究结论：1、小鼠脑缺血再灌注损伤后,缺血侧脑组织中AMPK过度激活,小鼠出现明显神经功能缺损症状,有明显的脑梗死灶形成；抑制AMPK活性以后,可明显改善小鼠神经功能缺损症状,缩小脑梗死体积,说明抑制AMPK活性对脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用；2、小鼠脑缺血再灌注损伤后,缺血侧脑组织中星形胶质细胞和小胶质细胞过度活化,星形胶质细胞上Cx43 mRNA表达减少,相关炎症因子TNFα、IL-1β和iNOS表达增加,NFκB/p65蛋白表达增加,抑制AMPK活性以后,抑制了星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化,促进Cx43 mRNA表达,减少TNF α、IL-1β、iNOS和NF κ B/p65表达,说明抑制AMPK活性可以抑制神经胶质细胞的过度活化,稳定星形胶质细胞的保护效应,抑制神经胶质细胞介导的神经炎症损伤,并进一步说明抑制AMPK活性的抗神经炎症的机制可能与抑制炎症上游NFκB信号通路有关；3、小鼠脑缺血再灌注损伤后,缺血侧脑组织中出现神经元细胞凋亡,同时AIF和Cyt.C释放增多,抑制AMPK活性以后,神经元细胞凋亡减少,AIF和Cyt.C的释放也减少,说明抑制AMPK活性可以抑制神经元细胞凋亡,其抗凋亡效应可能与抑制线粒体介导的凋亡途径有关。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3

【参考文献】