【摘要】：研究背景世界发达国家和新的经济增长体国家(如我国)都存在人口老龄化问题,老龄人群的快速增长已经为社会医疗和公共卫生服务带来了巨大挑战。无法回避的事实是相当比例的老年人正在经历着各种类型的疼痛。据调查,养老院里高达80%的老年人存在至少一项疼痛问题,超过40%的人正在经历难以忍受的疼痛。而老龄化过程本身也是各种类型疼痛的主要易感因素。研究显示,有些慢性痛的发病率随增龄而提高,如难治的顽固性外周神经病理性痛(带状疱疹后神经痛、糖尿病性神经痛)、中枢神经病理性痛(如中枢中风后疼痛)和痛性骨关节变性病等多发生在老年人,而青年人少见,提示老年痛具有特殊的生物学机制,但机制至今不清。最近我们实验室在新生、成熟和老化10几个年龄大鼠的研究上发现,无论在外周神经系统(PNS)还是在中枢神经系统(CNS),粗大的有髓神经纤维都最早出现变性样改变,我们把这个现象叫做髓鞘病变(myelinopathy)。髓鞘病变组织病理上可被分为I-III级,I级只累及髓鞘本身(如致密层解开、空泡、崩解、断裂),而iii级可累及轴突并导致其发生显著的变性。本博士学位论文在以往研究的基础上,重点观察和分析了躯体感觉初级传入神经元的外周突(如坐骨神经)和中枢突(脊髓后索)老化的年龄变化特点,然后探索髓鞘病变对脊髓背角(疼痛信息处理与加工的门户)的影响,期望从髓鞘病变的分子和细胞机制上找到老年痛发生的身体易感因素。研究目的1.观察大鼠躯体感觉系统外周和中枢神经纤维超微结构的年龄相关性变化;2.检测大鼠脊髓神经纤维髓鞘相关蛋白表达水平的年龄相关性变化;3.检测大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的年龄相关性活化状态;4.评价大鼠年龄对躯体感觉、躯体运动和模型大鼠痛行为的影响;5.探讨大鼠躯体感觉系统神经纤维老化变性的可能分子机制。研究意义应用电镜、免疫荧光等形态学方法,结合分子生物学技术和行为学手段,从躯体感觉系统神经纤维髓鞘结构的年龄相关性改变、胶质细胞年龄相关性活化、正常大鼠及神经病理性痛模型大鼠年龄相关性痛行为变化和炎性因子在老化过程中的动态改变等多个方面去探讨老年痛的可能机制。希望能够从老化相关髓鞘病变的发生发展中寻找老年痛发生的生物学风险因素。实验方法本课题应用透射电镜技术观察大鼠躯体感觉系统超微结构的年龄相关性变化;应用免疫学方法(免疫荧光和免疫印迹)检测大鼠脊髓中髓鞘相关蛋白表达水平的年龄相关性变化和大鼠脊髓内小胶质细胞和星形胶质细胞的年龄相关性活化状态;应用行为学手段评价大鼠躯体感觉、躯体运动的年龄相关性改变及年龄对疼痛模型大鼠痛行为的影响。最后为了探讨大鼠年龄相关性躯体感觉、躯体运动改变的可能机制,我们应用免疫标记和免疫印迹的方法检测不同年龄大鼠hmgb1及其受体rage的表达水平。实验结果1.大鼠躯体感觉系统神经纤维超微结构的年龄相关性变化大鼠躯体感觉系统超微结构呈现出显著的年龄相关性改变。生后2月龄大鼠坐骨神经和脊髓后索有髓神经纤维结构基本完整,且基质结构电子密度均匀。而12月龄时,其中部分有髓神经纤维发生了髓鞘病变。生后26月龄时,有髓神经纤维的病变更加明显,绝大部分髓鞘都出现了肿块形成、异源性物质沉积、髓鞘冗余、施-兰切迹崩解、内向或/和外向髓鞘褶皱、轴索挤压变形等。最终累及轴突发生退行性改变(轴突变性)。此外,老龄时期,基质成分丢失显著,纤维间距离增大。坐骨神经中无髓神经纤维也发生了年龄相关性的病理改变。生后2个月大鼠坐骨神经无髓神经纤维结构完整,呈现由施旺细胞单层突起包裹的数根纤维为一组的神经束状结构,而12月龄时,个别轴突中出现空泡样变性,但还未累及施旺细胞。26月龄时,病理变化加剧,束内的无髓纤维膜结构破坏严重,单根纤维结构不清,轴突内有空泡,电子致密度异常增高。此月龄,施旺细胞发生变性坏死,进而其包绕的无髓纤维发生整束的坏死,呈现 黑葡萄样‖结构。脊髓后索是粗大的初级传入有髓纤维进入后形成的上行纤维束路,观察显示其存在与外周同样的病理改变,少突胶质细胞也出现变性样改变。为了更好的对髓鞘结构的年龄相关性变化进行定量分析,我们使用本实验室提出的病理分级方法,对神经纤维病变进行分级定量。结果提示,坐骨神经中病变的有髓神经纤维和无髓神经纤维所占比例均随年龄增长显著增加;脊髓后索中病变的有髓神经纤维所占比例随年龄增长显著增加。2.大鼠脊髓中枢髓鞘相关蛋白表达水平的年龄相关性变化大鼠脊髓中枢髓鞘相关蛋白表达水平呈现显著的年龄相关性改变。2月龄大鼠脊髓后索髓鞘相关蛋白(o1、cnp、galc、mog等)依髓鞘结构呈现出完整的圆环状。dapi染色显示后索内细胞胞核均匀、散在分布。而老龄时期,髓鞘相关蛋白含量显著下降,特别是mog、cnp和galc,dapi阳性细胞核密度减少明显,并出现了细胞核聚集的现象。对脊髓细胞骨架分子进行标记,结果显示nf200的含量在老龄大鼠后索有小幅度的减少。用mbp和nf200双标显示,少突胶质细胞的突起穿行于神经纤维之间形成髓鞘,但老龄时的一个显著特征是在mbp和nf200共标记的纤维周围常可见密集的小直径细胞核聚集,而聚集细胞中dapi与mbp基本不共存,提示是非髓鞘形成细胞的核聚集所致。后续鉴定显示,聚集的细胞核与gfap不共存,但与iba1有共存现象,提示聚集细胞是小胶质细胞。对脊髓背根神经节(drg)细胞进行分类标记,结果显示无论是drg大细胞,亦或是中小细胞均未随年龄的增长发生数量上的改变。而对皮肤神经纤维标记后发现,神经纤维数量在中、老龄大鼠皮肤显著下降。同时,我们也检测了坐骨神经中髓鞘相关蛋白的表达情况。结果提示坐骨神经中cnp、pmp22和mbp的蛋白表达水平随年龄增长显著下降;老龄时期细胞骨架标记物(nf200)的表达水平也明显的下降。3.大鼠脊髓中枢小胶质细胞和星形胶质细胞的年龄相关性活化状态大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞发生了年龄相关性的活化增强。青龄大鼠脊髓中iba1阳性细胞很少,而在老龄时期,iba1阳性细胞大量增加,小胶质细胞活化明显。与白质区域(后索)相比,老龄大鼠灰质内(背角)小胶质细胞活化更为显著。后索中iba1阳性细胞密度老龄较青龄增加了约2倍,而在背角中,增加幅度接近4倍之多。且老化时,被激活的小胶质细胞表现出胞体和突起变大。与小胶质细胞相似,老龄时期星形胶质细胞活化明显,但分布灰、白质间无明显差别。4.大鼠年龄对躯体感觉、躯体运动和疼痛反应行为的影响我们分别利用pwmt、pwtl评价大鼠躯体感觉变化,利用rot-rod评价躯体运动功能年龄相关性改变。结果提示老龄动物(26月龄)械痛敏阈值显著升高、热痛敏潜伏期显著延长。躯体运动功能评价结果与躯体感觉类似,老龄时期,大鼠运动功能发生显著下降,在rot-rod上停留时间降低了几十倍。但当评价年龄对不同疼痛模型大鼠痛行为影响时发现,无论是炎性痛模型还是神经损伤痛模型,老龄大鼠痛时程显著延长。综合上述,提示老龄大鼠热和机械痛阈均提高(对痛迟钝),但炎性痛和神经病理性痛更易持续慢性化。5.老龄大鼠躯体感觉系统髓鞘病变的可能分子机制探索在前述结果的基础上,我们认为神经系统髓鞘和轴索发生崩解破坏后产生的物质会激活小胶质细胞和星形胶质细胞,产生免疫学反应,恶化原有损伤,引起一系列痛行为。因此检测了晚期炎症因子hmgb1及其受体表达的年龄相关性变化。结果提示,hmgb1及其受体rage在中、老龄动物脊髓后索、背角中显著高表达。与其高表达同时发生的还有胶质细胞的大量活化。与中枢神经系统类似,hmgb1在坐骨神经中的表达也具有年龄相关性,老龄时期显著增高3倍以上。RAGE在老龄时期的表达也增高了约20%。结论:1.髓鞘结构的病理改变具有年龄相关性,随年龄增长其破坏程度不断加重。提示在老化过程中,神经系统中髓鞘可能是最易受累的组织结构,同时也可能是最主要的老化作用靶点。2.髓鞘相关蛋白在老龄时期显著表达下调,使得髓鞘板层结构的稳定性遭到破坏,这可能是髓鞘结构出现年龄相关性病理改变的物质基础。3.正常大鼠老龄化过程伴随机械痛刺激阈值升高和热痛刺激潜伏期显著延长,提示痛敏感性降低,但老龄化可以延长痛反应的时程,提示老龄大鼠疼痛更易持续慢性化。4.小胶质细胞和星形胶质细胞在老化时均出现活化增强,且在出现退行性改变的髓鞘旁有小胶质细胞的聚集。胶质细胞的激活会诱发一系列炎性反应,导致脊髓处于一种敏化状态,这可能是导致疼痛慢性化的重要机制之一。5.老化过程中脊髓后索及背角中HMGB1及其受体RAGE表达大量增加,这可能是导致胶质细胞活化的重要分子机制。6.老龄动物外周皮肤神经纤维终末(PGP9.5)和热伤害性感受器(TRPV1)数量减少;在背根神经节中神经生长因子受体(TrkA)、热伤害性感受器标记物(TRPV1)的表达也发生了显著下降。这可能是老龄时期感觉减退的原因之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R744
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本文编号：
2489047
