α-硫辛酸对电点燃致痫大鼠海马的保护作用及其机制研究

发布时间：2019-07-23 06:04

【摘要】：目的：癫痫是一种慢性的神经系统疾病，以周期性复发和自发性发作为特点。在成人，颞叶癫痫是最常见也是最棘手的。除了癫痫发作的影响，病人还会因海马的进一步损害而发生认知功能的障碍。实验动物模型研究表明，短暂重复发生的癫痫会导致海马损伤进而导致一定程度的认知功能损害。癫痫确切机制还不十分清楚，可能的机制有：兴奋性氨基酸毒性学说、能量代谢失衡、钙超载、氧化应激、致炎因子损伤、细胞凋亡。研究发现，细胞凋亡信号通路是癫痫后神经元损伤的重要机制。Bax是参与诱导细胞凋亡的重要细胞因子。Bcl-2是抗凋亡蛋白，其生理功能是延长细胞寿命，防止细胞老化，阻遏细胞凋亡。脑源性神经营养因子(brainderived neurophic factor, BDNF)是1982年由德国神经化学家Barde等人首次从猪脑中分离纯化出一种蛋白质,具有促进神经生长活性的重要作用。BDNF作用于中枢神经系统和外周神经系统的某些特定神经元，有助于支持现有神经元的存活和促进新的神经元和突触的生长和分化。研究证实，癫痫发作能够形成神经细胞损伤及丢失，因此探寻新的神经保护剂具有重要的现实意义。硫辛酸是B类维生素物质，许多食物中存在比较丰富的硫辛酸，在人体中，硫辛酸存在于身体的各个部分，硫辛酸具有极强的抗氧化能力并且容易透过血脑屏障到达中枢神经系统，正因为如此其药理价值受到许多专家和学者的广泛关注。硫辛酸能够对抗氧化应激引起的细胞凋亡。还可抑制神经细胞老化过程中的细胞凋亡，提高细胞存活率。本实验采用成年雄性Wistar大鼠，通过杏仁基底外侧核电点燃法建立大鼠慢性癫痫模型，根据Racine分级评价癫痫发作的级别并记录癫痫大鼠持续后放电时间；并给予α-硫辛酸干预，观察干预前后大鼠癫痫发作的严重程度及持续时间，观察各组大鼠的行为学，海马组织形态学，并运用Western Blot及免疫组织化学方法在大鼠海马组织细胞中观察指标BDNF、Bcl-2和Bax的蛋白表达，以研究大鼠杏仁核电点燃癫痫模型中，α-硫辛酸的脑保护及抗癫痫作用，并进行探究其可能存在的机制。方法：将36只7-8周体重250-300g清洁级Wistar成年雄性大鼠随机分为：假手术组、正常对照组、癫痫组、正常硫辛酸组、电刺激硫辛酸低剂量组、电刺激硫辛酸高剂量组，每组各6只大鼠。正常对照组：0.9%的生理盐水40mg/kg大鼠每日腹腔注射，于早上08:30-09:30之间进行药物注射，共15次。假手术组：电极植入杏仁核后，不给予电刺激。癫痫组：植入电极后每天按120%发作阈值电刺激一次，电刺激15天。正常硫辛酸组：不做任何处置的大鼠α-硫辛酸按40mg/kg腹腔注射，共15次。电刺激硫辛酸低剂量组：杏仁核植入电极后，α-硫辛酸按20mg/kg腹腔注射30min后按120%发作阈值刺激一次/日，共15次。电刺激硫辛酸高剂量组：杏仁核植入电极后,α-硫辛酸按40mg/kg腹腔注射30min后按120%发作阈值刺激一次/日，共15次。电刺激后观察。依据Racine分级标准观察每组动物行为学表现。实验结束后24小时，灌注取脑，，每组取6只大鼠，用HE染色观察大鼠海马神经元损伤的影响，用免疫组织化学方法检测在海马CA1区Bcl-2、Bax及BDNF的蛋白表达情况。同时每组另取6只大鼠，断头取脑，生理盐水中快速分离海马,用Western Blot方法检测海马Bcl-2、Bax及BDNF蛋白表达水平。结果： 1行为学观察癫痫组大鼠经重复给予电刺激，发作等级逐渐升高，最终达到3次以上Ⅳ-Ⅴ级发作。电刺激硫辛酸低剂量组、电刺激硫辛酸高剂量组大鼠发作强度较癫痫组减轻，多集中在Ⅱ-Ⅲ级。正常对照组、正常硫辛酸组及假手术组大鼠无癫痫发作。 2HE染色结果正常对照组、假手术组及正常硫辛酸组：海马区神经元排列整齐,层次较多,形态正常,核仁清晰，胞浆透亮，染色质均匀分布，未见明显的神经元丢失。癫痫组:海马神经元的分布紊乱，边界不清晰，间隙增大，神经元丢失明显，呈嗜酸性细胞，包括细胞皱缩，染色质浓缩，核固缩；电刺激硫辛酸低剂量组、电刺激硫辛酸高剂量组：海马细胞形态趋于正常，排列整齐，细胞的剩余数量与癫痫组相比增加，只有一小数量的嗜酸性粒细胞。 3Western blot检测结果大鼠海马BDNF表达水平癫痫组较正常硫辛酸组、假手术组、正常对照组明显升高(P0.05),比电刺激硫辛酸低剂量组、电刺激硫辛酸高剂量组明显降低(P0.05)；bax蛋白癫痫组较正常硫辛酸组、假手术组、正常对照组、电刺激硫辛酸低剂量组、电刺激硫辛酸高剂量组明显升高(P0.05)。bcl-2表达癫痫组较正常硫辛酸组、假手术组、正常对照组、电刺激硫辛酸低剂量组、电刺激硫辛酸高剂量组明显降低(P0.05)。 4免疫组化结果癫痫组：大鼠海马CA1区BDNF的平均光密度值较正常硫辛酸组、假手术组、正常对照组明显升高(P0.05)；bax的平均光密度值较正常硫辛酸组、假手术组、正常对照组显著升高(P0.05)。与癫痫组相比，电刺激硫辛酸低剂量组、电刺激硫辛酸高剂量组大鼠海马CA1区BDNF、bcl-2的平均光密度值显著升高(P0.05)；bax的平均光密度值显著降低(P0.05)。结论: 1本实验采用慢性杏仁基底外侧核电刺激的方法成功建立了慢性电点燃癫痫模型，α-硫辛酸有效抑制电点燃致痫大鼠的癫痫发作，可以降低癫痫发作级别。 2癫痫可降低抗凋亡蛋白bcl-2在海马的表达，增加细胞凋亡蛋白bax表达。并上调BDNF的表达。 3α-硫辛酸能够上调BDNF、bcl-2表达，降低Bax的表达，推测癫痫后α-硫辛酸可能通过上调BDNF、bcl-2表达，降低Bax的表达，阻止细胞凋亡途径来发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

【参考文献】