ASIC1a对黑质纹状体多巴胺递质释放的调节及其分子机制

发布时间：2019-08-26 10:06

【摘要】：第一部分酸敏感离子通道1a在MES 23.5细胞以及斑马鱼体内的表目的:酸敏感离子通道(Acid sensing ion channels,ASICs)是一类胞外酸化激活的非电压门控的阳离子通道。本实验从基因和蛋白水平检测MES 23.5细胞和斑马鱼体内ASIC1a的表达,并研究该通道的功能特性,为初步探讨ASIC1a在帕金森病(Parkinson′s disease,PD)发病中的作用提供动物和细胞模型。方法:体外培养MES 23.5细胞,RT-PCR的方法在m RNA水平检测MES 23.5细胞ASIC1a的表达;Western blotting方法在蛋白水平检测ASIC1a的表达;细胞免疫荧光标记的方法确定ASIC1a在MES 23.5细胞上的分布;全细胞膜片钳检测ASIC1a电流特性;钙离子成像的方法检测MES 23.5细胞上ASIC1a通道的离子通透性。免疫荧光标记和整体原位杂交方法观察ASIC1a通道在斑马鱼体内的表达分布;全细胞膜片钳检测ASIC1电流特性;行为学实验检测ASIC1对斑马鱼视觉功能的影响。结果:(1)从基因和蛋白水平证实ASIC1a在MES 23.5细胞上有表达。ASIC1a主要分布在胞膜和胞浆,与酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)有共表达。(2)MES 23.5细胞胞外酸化可诱发出ASICs电流,该电流可被阿米洛利(Amiloride)和ASIC1a特异性抑制剂狼蛛毒素(Pc Tx1)阻断。(3)斑马鱼的脑部和眼球存在ASIC1基因和蛋白的表达,但是未能观察到与TH的共定位。(4)斑马鱼视网膜视神经节细胞上记录到ASICs电流。(5)阻滞ASIC1会造成斑马鱼视觉功能障碍。结论:(1)MES 23.5细胞上存在功能性ASIC1a的表达。(2)斑马鱼的视网膜上存在ASIC1的表达,主要分布在视神经节细胞层、内板状层、内核层、外板状层以及感光细胞层。阻滞ASIC1的活性能够降低斑马鱼对光的敏感性,提示ASIC1可能参与斑马鱼视觉功能的调控。本实验为探讨ASIC1a在PD发病中的作用提供了实验基础以及简单易行的模型。第二部分酸敏感离子通道1a对胞外酸化诱导的多巴胺递质释放的调控及其分子机制目的:研究ASIC1a对多巴胺递质释放的调节,探讨ASIC1a在PD发病中的作用机制,并观察阻滞ASIC1a能否减轻PD模型中DA神经元的损伤。方法:以MPP+诱导的MES 23.5细胞为研究对象,免疫印迹技术检测MES 23.5细胞ASIC1a、TH、Ca MKII的蛋白表达变化。全细胞膜片钳技术检测ASIC1a电流大小及电流特性的变化;高效液相色谱法检测细胞内外DA的水平,计算DA释放率[胞外含量/(胞内+胞外含量)×100%]。不同浓度Pc Tx1(0.1n M-10n M)预处理细胞1h,加入MPP+(10u M)作用12h后,MTT法测定各组细胞的存活率和损伤程度。结果:(1)在MPP+诱导的MES 23.5细胞模型中,ASIC1a蛋白水平和电流幅度显著增加。(2)以高钾刺激作为阳性对照,胞外酸化可明显增加MES 23.5细胞DA递质释放,该作用可被ASIC1a通道阻断剂Pc Tx1抑制。(3)在MPP+诱导的MES 23.5细胞模型中,Ca MKII蛋白水平显著增加;无钙外液和Ca MKII抑制剂KN-93减少酸化引起的DA递质释放增加。(4)MPP+处理12小时后,细胞存活率明显下降;Pc Tx1预处理1h,细胞存活率显著上升,与MPP+组相比有统计差异。(5)MPP+显著降低MES 23.5细胞中TH蛋白的表达;与MPP+组相比,Pc Tx1(10n M)预处理1h后,TH蛋白的表达明显升高。结论:组织酸化引起黑质DA神经元上ASIC1a的激活,增加Ca2+的内流,促进DA递质释放;同时Ca2+内流通过激活Ca MKII(Ca2+/Ca MKII信号通路),上调ASICla通道的功能,进一步促进Ca2+内流,造成胞内DA递质减少,最终导致DA递质耗竭、DA神经元损伤或凋亡。抑制ASIC1a的活性,可减轻其对DA神经元的毒性,从而对细胞发挥一定的神经保护作用。
【图文】：

基因表达,细胞,皮层神经元,程序结束

自动成像系统激动记录数据和视频。程序结束后，对数终运动活性值。据统计分析据分析的软件主要有： SPSS 17.0 和 GrapHPad Prism 6 统计验数据以均数±标准误表示。用 t-检验（ student’s t-test，包比较两组数据之间的差异性；多组间比较采用方差分析；不数检验。当 P < 0.05 为有统计学意义。结果S 23.5 细胞表达 asic1a mRNA实 MES 23.5 细胞上存在 ASIC1a，首先应用 RT-PCR 法在 M1a mRNA 的表达。以大鼠皮层神经元作为阳性对照， gapdh发现，asic1a 在 MES 23.5 细胞上有表达，目的基因大小为 1

细胞,分布特点,共表达,多巴胺

图 2：ASIC1a 在 MES 23.5 细胞上的蛋白水平表达。经元作为阳性参照物，GAPDH 作为内参。目的蛋白的分子量为S 23.5 细胞上 ASIC1a 的分布特点察 ASIC1a 在 MES 23.5 细胞上的分布，我们分别用 TH 抗体标标记 ASIC1a 通道，进行免疫荧光双标。如图 3 所示，绿色荧代表 TH，蓝色为 DAPI 标记的细胞核，结果发现， ASIC1 均胞质中，，并且和多巴胺合成的关键酶 TH 有共表达，提示在 MESC1a 的这种分布特点具有特异性。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5

【参考文献】