微小核糖核酸592对神经胶质瘤细胞株U251细胞凋亡的影响

发布时间：2019-09-04 20:19

【摘要】：目的研究微小核糖核酸592(miR-592)对神经胶质瘤细胞株U251凋亡的影响。方法首先通过定量聚合酶链反应(PCR)分析miR-592在28份神经胶质瘤与其临近癌旁组织中的表达水平;随后向U251细胞转染miR-592的拟合物,并通过流式细胞技术分析miR-592过表达对U251细胞凋亡的影响;通过生物信息学分析,找到miR-592的潜在靶分子,并通过荧光素酶双报告实验以及蛋白免疫印迹法等进行验证;进一步,转染U251细胞Runx2的下调siRNA,绘制细胞的生长曲线,并对U251细胞的凋亡进行分析。结果对28份神经胶质瘤组织和正常组织的定量PCR结果分析发现,miR-592在肿瘤组织中明显低表达;miR-592过表达能明显抑制U251细胞的生长;流式细胞分析结果显示,miR-592显著促进U251细胞凋亡:实验对照组晚期凋亡率为7.2%±0.68%,而转染miR-592组晚期凋亡率为17.47%±1.45%;荧光素酶双报告实验以及蛋白免疫印迹法实验结果发现miR-592直接靶向Runx2的3’-UTR来抑制Runx2蛋白的水平;接下来,向U251细胞转染Runx2的siRNA,绘制细胞的生长曲线,并通过流式细胞技术分析U251细胞的凋亡率。结论 miR-592通过直接靶向Runx2来诱导神经胶质瘤细胞凋亡,进而抑制肿瘤细胞的生长。
【图文】：

A)。为了进一步研究miＲ-592是否在胶质瘤的发生发展中发挥着功能性的作用，我们合成了miＲ-592的mimics，并合成随机序列的对照。脂质体转染U251细胞后，我们首先检测了miＲ-592的表达(图1B)，并通过MTT实验绘制生长曲线(图1C)。结果显示，过表达miＲ-592能明显抑制U251细胞生长。流式细胞实验对U251细胞的凋亡检测结果显示miＲ-592能显著性上调细胞凋亡率(图1D，表1)。A:miＲ-592在肿瘤和癌旁组织中的表达;B:转染mimics后miＲ-592的表达水平;C:MTT检测U251细胞生长;D:流式细胞仪检测miＲ-592过表达后U251细胞周期图1miＲ-592促进U251细胞凋亡。Table1ApoptoticrateofU251cellsinvariousgroupsGroupEarlyapoptoticrate(%)Ｒepeat1Ｒepeat2Ｒepeat3x±sLateapoptoticrate(%)Ｒepeat1Ｒepeat2Ｒepeat3x±sNC13．712．9214．5213．71±0．87．876．517．217．2±0．68MiＲ-59212．811．3514．6612．94±1．661618．917．517．47±1．45＊＊＊＊P＜0．01，vsNCgroup·167·国际神经病学神经外科学杂志2017年第44卷第2期

2．2Ｒunx2Ｒunx2是miＲ-592在U251细胞中的直接靶分子:为了进一步探究miＲ-592在神经胶质瘤细胞中的作用机制。通过查阅文献我们发现Ｒunx2在神经胶质瘤细胞中发挥着重要作用，，我们通过生物信息学分析发现miＲ-592能直接靶向Ｒunx2的3’-UTＲ。荧光素酶双报告实验也显示miＲ-592显著性的抑制带有Ｒunx2的3’-UTＲ的荧光素酶的活性(图2A)。为了进一步验证Ｒunx2是否是miＲ-592的直接靶分子，我们通过定量PCＲ的方法分析了Ｒunx2在神经胶质瘤组织和癌旁组织中的表达，结果显示Ｒunx2的相对表达在肿瘤组织中明显上调(图2B)。随后我们还通过westernblot的方法分析了转染miＲ-592后U251细胞Ｒunx2蛋白的表达，结果显示miＲ-592抑制Ｒunx2的蛋白水平(图2C)。以上结果表明，Ｒunx2是miＲ-592在U251细胞中的直接靶分子。A:荧光素酶双报告实验;B:定量检测Ｒunx2在肿瘤组织和癌旁组织中的表达;C:Ｒunx2在转染miＲ-592和NC后U251细胞中的表达图2Ｒunx2是miＲ-592在U251细胞中的直接靶蛋白2．3下调Ｒunx2表达水平抑制U251细胞生长并促进细胞凋亡为了研究Ｒunx2是否是miＲ-592在U251细胞中的功能性靶分子，我们设计了Ｒunx2下调的siＲ-NA。转染U251细胞后，westernblot实验验证Ｒunx2的表达(图3．A)。同时，我们也检测了下调Ｒunx2对U251细胞生长的影响，结果显示转染了Ｒunx2siＲNA的细胞生长明显比对照组低(图3．B)。流式细胞技术对周期的检测显示，Ｒunx2下调表达上调U251细胞的凋亡率(图3．C和Table2)。综上所述，下调Ｒunx2表达能重现miＲ-592过表达的表型，说明Ｒunx2是miＲ-592的功能性靶分子。A:westernblot验证siＲNA下调效率;B:MTT实验检测Ｒunx2下调后细胞生长情况;C:流式细胞仪分析Ｒunx2下调后细胞凋亡率图3下调Ｒunx2
【作者单位】： 滨州市中心医院肿瘤科;新疆医科大学第一附属医院儿外一科;
【分类号】：R739.4

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本文编号：2531977