免疫性脱髓鞘剂促周围神经再生的作用及机制的研究

发布时间：2019-09-11 21:01

【摘要】：周围神经损伤，尤其是节段性缺损损伤，长久以来都是临床医生面临的巨大挑战。长节段缺损造成患区感觉运动功能缺失，且恢复缓慢，恢复效果不佳，是最为严重的创伤之一，致残率高。目前，周围神经损伤修复方法虽已多种多样，但仍以自体神经移植作为“金标准”。除传统的神经断端吻合、自体/异体神经移植外，其他治疗方法如新型神经组织工程材料的开发与使用、种子细胞的培养与使用、神经营养因子的复合使用、电刺激疗法及新药物的研制正被广泛开发和研究。但是以上方法仅注意修复效果是否接近于自体神经移植，却忽略了神经损伤瓦勒氏变性本身需要较长时间这一问题。因此，寻找一种既注重修复效果又能缩短治疗时间的方法具有重要临床意义。目前，已经发现抗半乳糖神经酰胺抗体和豚鼠补体联用制备免疫性脱髓鞘剂可以促进挤压伤和横断伤后周围神经修复和再生。但是，何种配比下能达到最好的脱髓鞘效果不得而知；再者，脱髓鞘剂作用的原理也不甚明了；第三，这种脱髓鞘剂能否促进长节段神经缺损的恢复尚未研究。因此，本研究通过对脱髓鞘剂配比优化、脱髓鞘剂有效性、细胞正负性作用和其对大鼠坐骨神经15mm缺损自体神经修复后神经再生的促进作用进行了系统研究。以阐明脱髓鞘剂作用原理，评价其促神经生长能力。主要分为四个部分进行研究：第一部分免疫性脱髓鞘反应药物的配比优化目的：优化脱髓鞘剂配比，证明脱髓鞘剂有效性。方法：通过不同配比浓度的脱髓鞘剂对正常坐骨神经作用进行比较，采用甲苯胺蓝染色及透射电镜的方法观察实验结果，并对实验结果进行分析，筛选最优方案。结果：本实验中发现4种配比的脱髓鞘剂对坐骨神经的脱髓鞘作用均有效且并无明显差别。甲苯胺蓝染色和透射电镜结果显示4种脱髓鞘剂对神经的作用表现相同趋势。甲苯胺蓝染色1d时显示多数神经细胞肿胀、萎缩，排列稀疏，髓鞘边缘出现不整，厚薄不均等情况；电镜结果1d时显示髓鞘普遍开始皱缩，板层结构出现断裂或显示不清，部分神经元开始萎缩变性。而1w时无论是甲苯胺蓝染色还是透射电镜结果均显示正常神经细胞结构已大部分消失，仅残留很少新生有髓神经元。在电镜图片中对有髓神经元数量进行统计发现各配比间有髓神经元数量无统计学差异（p0.05）。结论：按抗Gal-C抗体/豚鼠补体原液绝对含量比=1:1的配比，配制步骤简单，减少药品污染和浪费，避免PBS溶液的干扰，优化后续实验分组，被认为是最优配比。并将此配比方案运用到后续实验。第二部分：免疫性脱髓鞘剂对神经元及雪旺细胞的影响目的：为验证脱髓鞘剂本身对主要神经元细胞和雪旺细胞的影响，以确定脱髓鞘剂的安全可靠性，并佐证了脱髓鞘剂促神经生长的原理。方法：利用无血清培养基培养较高纯度背根神经节神经元和脊髓前角运动神经元，并用常规方法培养高纯度雪旺细胞。将脱髓鞘剂加入背根神经节感觉神经元、脊髓前角运动神经元以及雪旺细胞中，通过免疫荧光染色和统计学分析观察免疫性脱髓鞘剂对各种细胞的影响。结果：通过以上方法培养出（93±5）%纯度的背根神经节细胞、（83±6）%纯度的脊髓前角运动神经元以及（92±2）%纯度的雪旺细胞，满足实验要求。加入脱髓鞘剂后，免疫性脱髓鞘剂对上述三种细胞均无促进生长或增殖作用或毒性作用。其中检测背根神经节神经元加入脱髓鞘剂和去离子水对照组培养后轴突长度分别为827.6±23.1和835.9±22.8；脊髓运动神经元加入脱髓鞘剂和去离子水对照组培养后轴突长度分别为374.6±24.7和377.2±26.1。雪旺细胞加入脱髓鞘剂和去离子水对照组培养后细胞数量分别为168537.3±12657.4和170519.1±13324.4。均无统计学差异（p0.05）。而利用活死细胞染色检测各组细胞，仅出现极个别死亡细胞。但是脱髓鞘剂对雪旺细胞有改变形态的作用，由梭形变为三角形或多边形。结论：通过以上实验结果可以看出，免疫性脱髓鞘剂对神经元及雪旺细胞均无正性及负性作用，但是它会对雪旺细胞形态发生改变，推测和它作用原理有关。第三部分免疫性脱髓鞘药物对大鼠长节段缺损的修复效果及机制的研究目的：评价脱髓鞘剂单一组分对神经的作用以及验证免疫性脱髓鞘剂对长节段神经缺损的促生长作用。进一步阐明脱髓鞘剂促进生长的原理。方法：通过动物实验、透射电镜、免疫组织化学、逆行示踪、RT-PCR、生物行为学等方法，从形态和功能综合评价免疫性脱髓鞘剂的促神经生长作用。并探索脱髓鞘剂促进神经生长的机制。结果：通过将脱髓鞘剂和各组分成分单一注射对比，证明了只有当脱髓鞘剂两种组分同时存在时，免疫性脱髓鞘反应才会发生，单独注射各个组分对神经几乎没有影响。坐骨神经指数分析方面可以看出，注射脱髓鞘剂组在各个时间点的数值优于各对照组，说明其促进靶肌肉运动功能恢复的能力是肯定的。透射电镜中分析神经元数量、再生神经面积、有髓神经平均直径及髓鞘化程度证明免疫性脱髓鞘剂在各个观察时间点可以明显促进神经生长（p0.05）；荧光金逆行示踪、肌肉HE染色和神经免疫组化双标染色都显示脱髓鞘剂在促神经再生和功能恢复方面具有明显的作用（p0.05）；RT-PCR反应结果显示免疫性脱髓鞘剂通过超敏反应使周围神经发生脱髓脱失，提前瓦勒氏变性过程，阐明了免疫性脱髓鞘剂的作用原理和促神经生长原理。结论：综上可以看出，免疫性脱髓鞘剂可以明显通过提前瓦勒氏变性脱髓鞘其进程的作用来缩短神经再生需要的时间，促进有利微环境的提早形成，促进神经再生和患肢功能恢复。是一种全新理念的治疗长节段缺损的新方法。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R745

【共引文献】