颞叶癫痫小鼠Pannexin通道的表达变化及其对痫性发作的调控

发布时间：2019-10-12 02:27

【摘要】：第一章匹罗卡品颞叶癫痫小鼠模型的建立及癫痫后海马神经元和胶质细胞病理改变的研究目的：建立C57BL/6小鼠匹罗卡品颞叶癫痫模型,探讨癫痫后小鼠海马神经元和胶质细胞病理改变。方法：6-8周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组。实验组腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(SE),对照组腹腔注射等量无菌生理盐水。SE后观察小鼠行为学表现并记录慢性期自发性痫性发作(SS)。SE后2h,24h,7d,15d,60d分别行海马组织NeuN和GFAP免疫组化染色,并以同样的分组方法检测相同数量的对照组小鼠。结果： 1.造模成功率为48.0%,总体死亡率为40.3%。模型小鼠在慢性期SS的发生率为87.5%,平均潜伏期为11.1+4.8天。SS多在昼夜交替时出现,持续时间一般为10-40秒,通常不超过1分钟。 2. NeuN免疫组化染色：匹罗卡品致SE后小鼠海马CA1-CA3区各层、齿状回门区均有不同程度的神经元缺失。其中CA1区在24小时以后,神经元损伤持续存在(P0.05),门区神经元损伤在SE后2h即出现,之后也无恢复；CA3区神经元早期有丢失,SE后7天有所恢复,慢性期后又再次出现CA3区神经元的损伤；DG区在SE后7天有短暂上升,余时间点变化相对不明显,少数情况下可见颗粒细胞呈现弥散化现象。 3. GFAP免疫组化染色：胶质细胞对痫性发作的反应在形态学上来说比神经元出现要晚,在SE后24h时细胞出现水肿样表现,表现为CA1、CA3及门区阳性表达面积增加(P0.05),；7d后各区域阳性表达面积增加明显(P0.05)；进入慢性期(2m)后阳性染色面积介于对照组和7d之间,形成胶质瘢痕。结论： 1.匹罗卡品颞叶癫痫小鼠模型表现出典型的海马神经元丢失及胶质增生病理改变。 2.C57BL/6小鼠匹罗卡品模型是一种理想的颞叶癫痫模型。第二章Pannexin通道蛋白在匹罗卡品颞叶癫痫小鼠海马的表达变化目的：探讨Pannexin通道蛋白在匹罗卡品颞叶癫痫小鼠海马的表达变化方法：6-8周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组。实验组腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(SE),对照组腹腔注射等量无菌生理盐水。SE后2h,24h,7d,15d,60d分别行海马组织Panxl和Panx2免疫组化染色及Panx1、Panx2与NeuN、 GFAP的荧光双标染色。结果： 1.在正常对照组,Panxl和Panx2均表达于CA1-CA3区锥体细胞层,在始层、透明层及辐射层可见Panx阳性神经元的散在分布；在齿状回结构中,颗粒细胞呈现阳性表达,齿状回分子层及门区亦可见Panx蛋白的散在表达；SE后Panx1和Panx2在海马主细胞层表达呈下降趋势,而Panx1在非主细胞区域(尤其是辐射层)表达增加。 2. Panx1、Panx2与NeuN荧光双标：在正常对照组,基本上所有Panx1及Panx2阳性的细胞均表现出NeuN染色阳性。双标记的Panx1Panx2阳性神经元,在CA1、CA3椎体细胞层7d时减至最低；Hilar区双标记的神经元在SE后各时期均下降 3.Panx1、Panx2与GFAP荧光双标：在对照组中,GFAP阳性的细胞均未见Panx1Panx2的表达,SE后的2h、7d、15d、60d可以观察到Panx1与GFAP共表达细胞,以CA1、CA3始层、辐射层最为明显,SE后7d及15d最为显著；整个过程中均未观察到Panx2与GFAP双重染色的细胞。结论： 1.匹罗卡品颞叶癫痫小鼠海马Panx1和Panx2通道蛋白存在动态表达变化。 2.SE后Panx1通道蛋白在小鼠海马星形胶质细胞中显著表达。第三章Pannexin通道对颞叶癫痫小鼠痫性发作及海马神经元.胶质细胞可塑性的调控目的：探讨在活体内阻断Panx通道对匹罗卡品诱导的痫性发作的影响,并观察慢性期(SE后60d)海马神经元及胶质细胞病理的变化。方法：6-8周龄健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为Cbx干预组、10Panx干预组及ACSF对照组,分别予侧脑室注射Cbx、10Panx及ACSF。5小时后行匹罗卡品颞叶癫痫模型制作。在给药后2个小时内观察第一次出现3级发作的间隔时间、各级别痫性发作所占的比例及死亡率。SE后60d各组小鼠分别行海马组织NeuN和GFAP免疫组化染色。结果： 1.癫痫敏感性测定结果显示：10Panx干预组及Cbx干预组出现第一次3级或以上发作的平均时间分别为71.40±37.33min及59.53±34.69min,均较ACSF对照组(18.10+6.45min)显著延长。此外,各组痫性发作的严重程度也有不同,空白对照组5级以上发作占50%,而10Panx干预组及Cbx干预组5级以上发作分别仅占20%及13.3%。2小时内三组的死亡率分别为20%(10Panx干预组),13%(Cbx干预组)及40%(ACSF对照组)。 2. NeuN免疫组化染色：SE后60天各组小鼠海马CA1-CA3区各层、齿状回门区均有不同程度的神经元缺失。与ACSF对照组相比,10Panx干预组及Cbx干预组在SE后60天海马CA1、CA3区锥体细胞层神经元受损相对较轻(P0.05),10Panx干预组门区神经元也可观察到同样现象(P0.05),DG区差异相对不明显。 3. GFAP免疫组化染色：三组均可观察到胶质细胞的形态学改变。10Panx干预组及Cbx干预组在海马CA1区及Cbx干预组在DG区胶质增生均较对照组程度轻(P0.05),其余区域胶质增生在干预组及对照组并无显著差异。结论： 1.在活体阻断Panx通道可以抑制匹罗卡品诱导的痫性发作。 2. Panx通道可能参与颞叶癫痫海马神经元-胶质细胞可塑性的调控。
【图文】：

结构图,海马,纤维联系,冠状

海马冠状切面结构图示

细胞增生,软件分析

倍、40倍物镜下观察各区胶质细胞形态改变。胶质细胞增生的分析使用ImageTool软件(UTHSC) [17](图1-2)。首先设定一个代表阳性染色的阈值，达到阈值的染色区域将由系统自动转变成纯黑色，而之外的区域则变为纯白色区域，软件自动计算出黑色区域占整个切片区域的百分比，由此来计算胶质细胞的增生程度。：’".k- ■ - .Jt图1-2使用ImageTool软件分析胶^阆赴錾为SE后60d模型小鼠CA3区GFAP免疫组化染色原图（x4()0 ); B为软件处理后的黑白图像。1.2.5.4统计学处理实验数据均采用均数±标准差（S±s)表示，成组设计多样本均数用单因素方差分析（ANOVA)或Wilcoxon秩和检验，实验组与对照组间比较用两样本t检验或Wilcoxon秩和检验，检验水准a=0.05。统计分析和图表绘制分别用SPSS17.0 统计软件和 Microsoft Office Excel 2010 进行。1.3结果1.3.1 Pilo致TLE模型小鼠的行为学观察1.3.1.1模型小鼠SE的行为学特点对照组及实验组小鼠腹腔注射东莨菪碱硝酸甲酯后，，未表现特殊反应；实验组小鼠注射匹罗卡品5?15分钟后
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

【参考文献】