硫氧还蛋白1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2019-10-28 23:43

【摘要】：背景：硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)是种存在于真核生物和原核生物中的小分子蛋白，拥有多种生物学功能。在Trx的多种成员中，Trx1被研究得最广泛。研究表明Trx1具有抗凋亡、抗氧化、抗肿瘤和抗炎等作用。近年来发现Trx1可以明显减小脑缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积和改善大鼠的神经功能症状，在脑缺血再灌注损伤疾病防治方面具有很好的运用前景。目的：探讨Trx1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其相关的保护机制。方法：运用改良Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。将实验动物随机分为假手术组(sham)、缺血再灌注损伤组(MCAO)、MCAO+非特异性siRN（AControl siRNA）和3条特异性siRN（ATrx1siRNA1、Trx1siRNA2、Trx1siRNA3）处理组。处理组于MCAO模型前24h采用左侧侧脑室注射。观察Trx1是否具有神经保护作用并探讨其相关的可能机制：（1）大鼠脑缺血1h再灌注24h后，将大鼠断头处死并取脑组织蛋白。利用Western blot蛋白印迹及Quantitative PCR法检测Trx1蛋白及mRNA国家自然科学基金资助(No.81171090)在大鼠脑组织中的表达，筛选出高效的Trx1干扰序列。（2）对Sham组、MCAO组、MCAO+Control siRNA和MCAO+Trx1siRNA组大鼠进行死亡率的评估和神经功能评分；应用TTC染色法评估脑梗死体积；采用HE及尼氏染色法进行组织学观察；TUNEL法检测神经元凋亡。（3）采用免疫共沉淀法（Co-IP）检测Trx1-ASK1的结合情况。Western Blot测定ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、p38、P-p38、cytochrome c和cleavedcaspase-3蛋白的表达。结果：（1）与非特异性的Control siRNA组相比，，3条针对Trx1的siRNA均明显抑制Trx1mRNA及蛋白质的表达，而siRNA2对Trx1的抑制作用最强，其干扰效率达50%以上。（2）Trx1siRNA能明显增加脑缺血再灌注损伤后大鼠的死亡率、神经功能评分、脑梗死体积和神经元的凋亡率和死亡率。（3）Trx1siRNA能显著增加Trx1-ASK1的分离，增强P-ASK1、P-JNK、P-p38、cytochrome c和cleaved caspase-3凋亡相关蛋白的表达水平。结论：（1）siRNA能特异性抑制体内Trx1基因的表达，Trx1siRNA处理会加重大鼠脑缺血再灌注损伤。（2）Trx1的脑神经保护作用可能通过抗凋亡实现，而抑制凋亡信号调节激酶1（ASK1）及其介导的下游信号通路JNK/P38可能是其实现神经保护作用的重要机制之。
【图文】：

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重庆医科大学硕士研究生学位论文采用 SPSS19.0 软件进行统计分析。数据用均数±标准差（ X ±S）表示，组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)结合 Post Hoc 检验分析，p<0.05 认为差异具有统计学意义。3 结果3.1 Quantitative PCR 对 Trx1 最佳干扰序列的筛选qPCR 检测 Trx1 mRNA 在大鼠脑组织中的表达（图 1），以筛选出高效干扰大鼠Trx1 基因的 siRNA。与 sham 组相比，MCAO 和 control siRNA 组中 Trx1 mRNA 明显升高(P<0.05）。而与阴性对照组相比，3条针对Trx1的siRNA 均明显抑制Trx1 mRNA的表达，而 siRNA2 对 Trx1 的抑制作用最强，其干扰效率达 50%以上。2.7 统计分析

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重庆医科大学硕士研究生学位论文3.2 Western blot 对高效 Trx1 siRNA 序列的筛选Western blot 检测 Trx1 蛋白在大鼠脑组织中的表达（图 2），以筛选出高干扰大鼠 Trx1 基因的 siRNA。与 sham 组相比，MCAO 和 control siRNA 组中 Trx1白明显增加(P<0.05）。而与阴性对照组相比，3 条针对 Trx1 的 siRNA 均明显抑Trx1 蛋白的表达，同样 siRNA2 对 Trx1 的抑制作用最强，其干扰效率达 50%以Western blot 和 RT-qPCR 筛选结果致。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

【参考文献】