缺血性脑卒中CNS表达MHC Ⅰ类分子的靶向成像及TLR4特异性阻断治疗的实验研究

发布时间：2019-11-02 10:30

【摘要】：既往研究认为,中枢神经系统(Central nervous system,CNS)是免疫豁免区,正常生理情况下的成年动物CNS不表达MHC Ⅰ类分子或表达量极低,近年来研究表明CNS感染及损伤刺激能够诱导MHC Ⅰ类分子的表达,且该分子与脑组织的二次损伤和修复过程密切相关。研究已经证实小鼠缺血性脑卒中7天后MHC Ⅰ类分子表达增强。作为世界范围内致死致残率最高的疾病之一,提高对脑卒中的诊断与治疗水平,降低脑卒中的致残率和死亡率是当务之急。缺血半暗带的存在是急性缺血性脑卒中血管再通以及血管神经保护治疗的理论基础和关键靶点。而缺血性脑卒中急性期MHC Ⅰ类分子的时空特异性表达情况,以及MHC Ⅰ类分子是否能够用作脑缺血成像分子靶标的研究未见报道。这两项研究不仅对进一步了解该分子参与缺血缺氧性脑损伤及修复的机制有重要意义,也对缺血性脑卒中的靶向性成像具有重要应用价值。本研究首先在小鼠脑缺血性卒中模型及体外神经元缺氧缺糖模型中检测了MHC Ⅰ类分子表达变化：接着利用生物信息学方法筛选能与小鼠MHC Ⅰ类分子H-2K~b、H-2D~b均能高亲和结合的肽；验证该肽的特异性及亲和性后,利用体外神经元OGD模型探索修饰肽的结合模式；在小鼠脑缺血卒中模型中以MHC Ⅰ类分子靶向性探针进行活体成像,获得如下结果：1、在小鼠MCAO卒中模型中,缺血6小时、24小时缺血侧脑组织MHC Ⅰ类分子显著强于对侧脑组织：在小鼠光化学法诱导皮层缺血卒中模型中,我们发现3小时组MHC Ⅰ类分子表达量最高,在24小时内随着时间点的推移,上调表达幅度逐渐降低。且发现在两种缺血卒中模型检测的各时间点,Western blot检测缺血侧MHC Ⅰ类分子表达量均高于对侧,MHC Ⅰ类分子的55KDa条带差异比45KDa更显著。原代培养皮层神经元OGD模型发现MHC Ⅰ类分子在缺氧2小时或4小时后,在复氧24小时内,随着复氧时间的延长,表达量逐渐升高。以上结果提示体内及体外缺氧模型中诱导表达MHC Ⅰ类分子的机制可能不一致。MHC Ⅰ类分子在缺血性脑卒中发病后超急性期(发病6小时内)显著上调表达的模式,提示该分子可以作为缺血性脑卒中早期成像的潜力靶标。2、生物信息学方法筛选获得小鼠H-2K~b/H-2D~b靶向多肽--H2BP,以人工神经网络(ANN)方法预测H2BP与H-2K~b的亲和力为51nM,与H-2D~b的亲和力为3nM。H2BP-MHC Ⅰ复合体/gp33-MHC Ⅰ复合体与CNS可能配体Ly49A分子对接及打分后,预测H2BP-MHC Ⅰ复合体、gp33-MHC Ⅰ复合体分别引起的Ly49A通路活化状况可能与外周免疫系统TCR通路的情况类似,即H2BP-MHC Ⅰ对Ly49A分子的亲和力低于gp33-MHC Ⅰ复合体。以上结果提示H2BP肽能够与MHC Ⅰ类分子发生紧密结合；且在H2BP肽-MHC Ⅰ复合体与CNS受体相互作用中,MHC Ⅰ类分子抗原结合槽内的H2BP肽可能具有重要的影响。3、流式细胞术检测结果显示,FITC-H2BP与两种品系小鼠来源的脾细胞结合百分比差异明显,C57BL/6脾细胞阳性率明显高于Babl/c脾细胞,说明本研究所用FITC-H2BP能够较好的区分H-2K~b、H-2D~b分子与H-2Kd、H-2Dd分子。进一步以H-2K~b-/-D~b-/-小鼠与C57BL/6野生型小鼠脾细胞进行流式细胞检测发现,FITC-H2BP肽在两组小鼠的流式检测中也存在明显差异,而FITC-control peptide则不能体现出组间差别。OGD模型成像结果证明,FITC-H2BP肽与Tuj1标记的神经元结合能力明显强于FITC-control peptide组,说明缺氧诱导神经元表达的MHC Ⅰ类分子具有抗原递呈功能,且FITC-H2BP肽能够以竞争低亲和及中等亲和表位肽的形式与神经元表面诱导上调表达的MHC Ⅰ类分子特异性结合。细胞毒性实验证明Cy5.5-H2BP近红外荧光成像分子探针对神经元毒性低,说明Cy5.5-H2BP近红外荧光成像分子探针能够用于缺血性脑卒中模型小鼠的活体成像研究。4、在小鼠光化学法诱导皮层缺血卒中模型的活体成像研究中,结果显示FITC-H2BP探针在小鼠缺血侧半脑有明显强于对侧半脑的信号分布。Cy5.5-H2BP探针在脑缺血性卒中模型小鼠活体近红外荧光信号分布结果显示,探针尾静脉注射5小时后,Cy5.5-H2BP分子探针在缺血侧半脑有明显强于对侧半脑的信号分布,而对照探针Cy5.5-Control组在缺血侧/对侧未见明显的荧光信号差异。离体脑组织及心肺等主要脏器组织近红外荧光信号检测的结果表明,与对照探针Cy5.5-Control相比,Cy5.5-H2BP不仅在脑组织具有更强的荧光信号,同时脑组织荧光信号强度远高于心、肝、肺组织的荧光信号强度,进一步说明Cy5.5-H2BP近红外荧光成像分子探针在脑缺血小鼠体内具有良好的缺血脑组织靶向性。5、神经元OGD诱导TLR4分子主要表达于神经元胞体及树突；MD2MP肽能够特异性结合小鼠细胞表面的TLR4分子,对于LPS或OGD诱导的神经元TLR4通路活化MD2MP肽均有靶向抑制效应；在OGD诱导的神经元损伤中,MD2MP有明显的挽救作用,并且MD2MP肽对缺血性脑卒中小鼠也有较理想的治疗效果。以上结果表明MHC Ⅰ类分子能够作为缺血性脑卒中急性期成像的分子靶标,Cy5.5-H2BP分子探针能够用于小鼠脑缺血性卒中模型活体近红外成像,MD2MP肽能够对缺氧缺血性损伤的神经元提供神经保护作用。我们的研究将为进一步研究和证明MHC Ⅰ类分子在脑缺血病理损伤和组织修复的机制以及脑卒中病情发展与治疗效果的可视化奠定一定的理论和实验基础。
【图文】：

小鼠大脑,中动脉,类分,模型

图２－２线栓法小鼠大脑中动脉阻塞（ＭＣＡＯ）卒中模型缺血后再灌注６小时，ＭＨＣ邋Ｉ类分逡逑子表达模式。Ａ．ＭＨＣＩ类分子在缺化侧（Ｒ）义对侧（Ｌ）半脑均有表达，缺化侧皮层、纹逡逑状体部位细胞的ＭＨＣＩ类分子表达景均强于对侧同一部位细胞，标尺长度表术ｌＯＯｕｍ。Ｂ．逡逑ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＭＨＣ邋Ｉ类分子在缺血侧（Ｒ）及对侧（Ｌ）半脑各部位的表达情况（ｎ＝４）。逡逑缺血再灌注２４小时后，组织免疫巧光染色发现，ＭＨＣ邋Ｉ类分子在大脑左右逡逑侧半脑均有表达，但缺血侧皮层部位细胞表达百分比均高于对侧脑同一部位细逡逑胞。定量检测缺血后再灌注２４小时脑组织各部分的ＭＨＣ邋Ｉ类分子表达情况，逡逑我们根据６小时的表达变化，对２４小时脑组织蛋白仅按照缺血侧（Ｒ）及对侧逡逑（Ｌ）半脑区分进行检测，Ｗ小鼠来源单克隆抗体ＯＸ－１８同样检测到４５ＫＤａ与逡逑５５ＫＤａ两条特异性带，缺血侧比对侧半脑ＭＨＣＩ类分子表达量显著升高，且缺逡逑血侧半脑比对侧半脑条带差异主要在５５ＫＤａ处，与６小时的检测结果一致。逡逑

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—逦广？幽邋一邋，４３逡逑图２－２线栓法小鼠大脑中动脉阻塞（ＭＣＡＯ）卒中模型缺血后再灌注６小时，ＭＨＣ邋Ｉ类分逡逑子表达模式。Ａ．ＭＨＣＩ类分子在缺化侧（Ｒ）义对侧（Ｌ）半脑均有表达，缺化侧皮层、纹逡逑状体部位细胞的ＭＨＣＩ类分子表达景均强于对侧同一部位细胞，标尺长度表术ｌＯＯｕｍ。Ｂ．逡逑ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＭＨＣ邋Ｉ类分子在缺血侧（Ｒ）及对侧（Ｌ）半脑各部位的表达情况（ｎ＝４）。逡逑缺血再灌注２４小时后，组织免疫巧光染色发现，ＭＨＣ邋Ｉ类分子在大脑左右逡逑侧半脑均有表达，但缺血侧皮层部位细胞表达百分比均高于对侧脑同一部位细逡逑胞。定量检测缺血后再灌注２４小时脑组织各部分的ＭＨＣ邋Ｉ类分子表达情况，逡逑我们根据６小时的表达变化，，对２４小时脑组织蛋白仅按照缺血侧（Ｒ）及对侧逡逑（Ｌ）半脑区分进行检测，Ｗ小鼠来源单克隆抗体ＯＸ－１８同样检测到４５ＫＤａ与逡逑５５ＫＤａ两条特异性带
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

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