成人外周血多能干细胞对帕金森病大鼠的治疗作用

发布时间：2019-11-05 16:50

【摘要】：研究背景 帕金森病是一种神经系统变性疾病,主要特点是纹状体区的多巴胺能神经元的持续丢失。目前,对帕金森病得主要治疗方法是多巴胺替代治疗。然而,这种替代治疗只是在初期有效,随着疾病的进展,有效性会逐渐下降,并且会产生运动系统的并发症。因此,替换治疗是很必需的。具有自我更新和向其他细胞分化功能的干细胞可能会为帕金森病的治疗提供一种方法。从胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、骨髓间充质干细胞获得多巴胺能神经元有技术和伦理上的限制。而成人外周血来源的多能干细胞(peripheral blood insulin-producing cells, PB-IPC)能克服以上困难。本研究将分离、培养好的PB-IPC移植入帕金森大鼠模型的黑质致密部(SNC)和纹状体(CPU),并对其分化和疗效情况进行初步观察。 研究方法 1.外周血来源的多能干细胞的制备 采集健康志愿者的外周血,加入淋巴细胞分离液分离单个核细胞,加入红细胞分离液分离红细胞。分离出单个核细胞,用无血清培养基培养。 2.实时定量PCR 采用实时定量PCR检测胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子。使用Qiagenkit提取细胞总RNA,根据Applied Biosystems公司的反转录试剂盒将说明书将总RNA合成为单链cDNA。以ABI Prism7300HT Fast Real-Time PCR System进行实时定量PCR检测,反应体系如下：50℃,2分钟；95℃,2分钟；65℃,60s×40个循环。结果以β-actin作为内参。 3.帕金森大鼠模型的制备 将6-OHDA定向注射到大鼠的MFB和SNC,并皮下注射阿扑吗啡鉴定帕金森动物模型是否制作成功。 4.旋转行为学的测定 术后第三周开始观察行为学变化,阿朴吗啡(APO)腹腔注射(0.5mg/kg)。若大鼠恒定转向左侧,且旋转圈数210r/30min,则视为PD大鼠模型制备成功。移植后分别在2周、4周、6周、8周,观察大鼠旋转行为学的改变。 5.免疫荧光染色 PB-IPC移植后8周时,每组各取3只大鼠行心脏灌流固定取脑,30%蔗糖脱水后制作20um冰冻切片。每只大鼠取移植位点附近脑组织断面切片2张,0.5%Triton作用15分钟,山羊血清封闭20分钟后,加入TH—抗(1：800)、DAT—抗(1：400),置于湿盒内4℃过夜；第二天PBS洗3次后加入相应荧光二抗。 6.ELISA检测 以预冷的PBS(0.02mol/L, pH7.0-7.2)充分冲洗待测的组织块,称取组织块的重量。以1：9的比例(即1g组织块：9ml PBS)做成10%的脑组织匀浆,于4℃5000r/min,离心15min,取上清,采用ELISA法测上清液中多巴胺神经递质的含量。 研究结果 1. PB-IPC表现出类似脐带血多能干细胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形态和生长特点 PB-IPC表现出类似脐带血多能干细胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形态和生长特点：圆形或椭圆形,贴壁生长、扩增 2. PB-IPC表达胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子 PB-IPC表达胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神经元分化的转录因子Ngn1、Ngn2和Mashl; 3. PB-IPC移植后,实验组的旋转行为学有明显改善 术后第2、4、6、8周计算PB-IPC移植组PD大鼠在阿扑吗啡诱导后30min内的旋转圈数,较术前分别减少了(26±2)%、(34±4)%、(39±7)%和(37±5)%,而对照组无明显改变,各观察点结果同对照组相比均有统计学意义(P0.05) 4.移植入PD大鼠的PB-IPC分化为成熟的多巴胺能神经元 移植后8周,可见移植入PD大鼠Brdu阳性的PB-PC(80±3.41)%表达TH,(754±7.07)%表达DAT,对照组PD大鼠的脑组织切片没有Brdu、TH和DAT表达阳性的细胞存在。 5.移植的PB-IPC具有释放多巴胺神经递质的功能 通过ELISA实验数据分析,移植组上清液中多巴胺含量大约为(1954.12±14.79)pg/g,对照组上清液的多巴胺含量大约为(1687.94±14.82)pg/g。移植组的多巴胺含量明显高于对照组,P0.05。 结论 1.PB-IPC表达胚胎干细胞多向分化潜能相关的转录因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神经元分化的转录因子Ngnl、Ngn2和Mash1 2. PB-IPC移植入PD大鼠后,能分化为成熟的多巴胺能神经元,能有效治疗PD模型大鼠。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 赵卿;高俊鹏;李文伟;蔡定芳;;前凋亡分子CHOP/GADD153的生物学特性及其在帕金森病发病中的意义[J];国际神经病学神经外科学杂志;2009年05期

2 刘卫鹏;王君;屈素清;杜侃;杨辉;杨印祥;汪兆艳;栾佐;;人神经前体细胞移植治疗儿童广泛性发育障碍初探[J];中国当代儿科杂志;2013年10期

3 Xiao-Bing Zhang;;Cellular Reprogramming of Human Peripheral Blood Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

4 李玲玲;孙艺学;王爱兵;李子义;张学明;;人α-突触核蛋白A30P突变对小鼠成体大脑吻端迁移流中神经发生的抑制作用及其机制[J];吉林大学学报(医学版);2013年06期

5 陈琳;彭芳;郁可;林杭;王庆松;;α-突触核蛋白与帕金森病关系的研究进展[J];广东医学;2013年23期

6 张君度;龙大宏;陈艳;刘菲菲;;胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞分化过程中bHLH转录因子的表达变化[J];解剖学研究;2013年06期

7 杨军政;李永海;李萌;林俊堂;;脐带血间充质干细胞向神经细胞诱导分化及应用[J];重庆医学;2014年03期

8 吕铁伟;孙慧超;张蕾;刘玲娟;吴晓云;刘晓燕;朱静;刘振国;田杰;;ox-LDL抑制大鼠骨髓间充质干细胞的体外增殖和Oct-4表达[J];重庆医学;2014年14期

9 晏振;吴林;薛丹丹;高先琦;陈文芳;;人参皂苷Rg1和IGF-Ⅰ对帕金森病小鼠DA能神经元作用[J];青岛大学医学院学报;2014年04期

10 屠建棋;杨欣欣;窦珊珊;程葆华;徐旭东;;小胶质细胞与帕金森病[J];华西医学;2010年05期

相关博士学位论文 前10条

1 马芹颖;快速老化小鼠SAMP8老化过程中自噬的改变以及mTOR信号通路功能研究[D];河北医科大学;2011年

2 郑慧芬;自噬在系统性炎症所致黑质多巴胺神经元损伤中的作用及机制研究[D];苏州大学;2013年

3 朱天琦;GDNF和NT-3双基因诱导BMSCs分化为神经样细胞的实验研究[D];华中科技大学;2013年

4 鲁珊珊;磁粒子标记骨髓间充质干细胞经动脉移植治疗犬脑梗死的MR成像研究[D];南京医科大学;2013年

5 王喜梅;Sitagliptin对缺氧环境下骨髓间充质干细胞的保护作用及相关机制研究[D];北京协和医学院;2013年

6 孔滨;RNA干扰GCase对α-突触核蛋白的影响及其机制的初步研究[D];第三军医大学;2013年

7 裴志勇;地黄低聚糖对同种异体脂肪组织来源干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死效应及机制的研究[D];中国人民解放军医学院;2011年

8 袁盈;“颅底七穴”治疗帕金森病的临床疗效评价研究[D];中国中医科学院;2013年

9 张嵬;hUC-MSC_S/hHGF基因修饰的hUC-MSC_S移植在心肌损伤修复中的实验研究[D];天津医科大学;2013年

10 龙乾发;Hes1基因沉默的骨髓间充质干细胞对癫痫的治疗作用[D];第四军医大学;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 邓华明;蛇床子素对LPS诱导的小胶质细胞活化的影响[D];暨南大学;2011年

2 刘洋;线粒体解耦联蛋白2与帕金森病的相关性[D];南京医科大学;2011年

3 郭文琼;肝脏X受体通过抑制中脑炎症保护小鼠黑质多巴胺能神经元的实验研究[D];第三军医大学;2011年

4 常静;Kir6.2基因敲除对MPTP急性神经毒性的影响[D];南京医科大学;2008年

5 张国锋;小胶质细胞对次声损伤的反应变化及对原代培养神经元的影响[D];第四军医大学;2009年

6 丁方香;深部脑刺激在探究束旁核和内侧苍白球的联系中的应用[D];山东师范大学;2013年

7 余列;骨髓单个核细胞移植对脑梗死大鼠新血管形成的影响[D];郑州大学;2013年

8 陆乐;自主运动对小鼠学习记忆及海马神经发生的影响[D];华东师范大学;2013年

9 魏建强;不同途径移植骨髓间充质干细胞促进创伤性脑损伤大鼠功能恢复和神经再生的研究[D];河北医科大学;2013年

10 吴元桢;新生树，

本文编号：2556254