依维莫司对实验性自身免疫性神经炎治疗作用的实验研究

发布时间：2019-11-16 03:35

【摘要】：研究背景及目的:吉兰巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是一种影响周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)的自身免疫性疾病和急性炎症性疾病,是目前世界范围内最常见的急性弛缓性瘫痪原因之一,是严重的神经系统突发事件的主要来源[1]。实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)已经作为GBS的经典动物模型被广泛接受。巨噬细胞在炎性环境中有两种模式,即具有促炎作用的M1模式,和具有抗炎作用的M2模式,他们之间可以互相转化[2-3]。依维莫司(RAD001)属于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制剂,作为强有力的免疫调节剂,已被用于治疗癌症和自身免疫性疾病[4-10]并且发挥了积极的作用。截至目前,许多抗炎、免疫调节剂及单克隆抗体均作为治疗GBS的可能选择而在EAN上试用,但有关RAD001对于GBS的调节及治疗作用尚无报道。基于以往关于RAD001免疫调节作用的研究,我们假设RAD001对于EAN具有抗炎和神经保护作用,分别在EAN大鼠的免疫阶段和发病阶段应用RAD001进行药物干预,通过观察EAN大鼠的临床评分、病理变化、电生理指标、M1/M2巨噬细胞表型的分布和炎性环境变化,来分析m TOR通路的抑制和Akt的激活对EAN的作用,进而评价RAD001对EAN大鼠的治疗作用,并探讨其作用机制。研究方法:乳化P0180-199肽段后,诱导Lewis大鼠成模。将造模后的大鼠随机分组,分为对照组,RAD001预防用药组和治疗用药组。采用双盲法观察并评估大鼠每天的临床症状。在疾病高峰期,即免疫后第16天,进行坐骨神经肌电图检测评估坐骨神经电生理受损情况,指标包括诱发复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)波幅、潜伏期和运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity,MNCV)。在疾病高峰期,对大鼠坐骨神经进行取材,准备进行组织病理学检测评估炎症细胞浸润和脱髓鞘情况,并进行免疫荧光检测分析巨噬细胞分化情况;同时提取坐骨神经总蛋白,进行蛋白印迹分析,探讨m TOR通路蛋白变化情况。在疾病高峰期,对大鼠脾脏取材,提取单个核细胞,分析淋巴细胞增殖情况,采用聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测炎性细胞因子表达情况及应用流式细胞术检测巨噬细胞分化情况。应用Graph Pad Prism 5.0软件对资料进行统计分析,p0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.与对照组相比,两个RAD001治疗组均可改善EAN大鼠高峰期的临床症状,预防组可延迟EAN大鼠的发病时间。RAD001治疗可以减轻EAN引起的周围神经损伤。与对照组相比,RAD001预防组和治疗组炎性细胞数量减少,髓鞘脱失程度减轻(p0.05)。神经电生理检测表明,控制组MNCV明显减慢,两个治疗组CMAP明显升高,潜伏期显著缩短。2.Western印迹分析RAD001对于EAN大鼠坐骨神经中p-P70S6K、p-4E-BP1和p-Akt的作用,发现与对照组相比,RAD001预防组和治疗组中EAN大鼠坐骨神经切片中p-Akt表达增加,p-4E-BP1和p-P70S6K表达减少(p0.05)。3.P0180-199刺激后,相对于对照组的OD值(2.35±0.34),在预防组(0.98±0.16),和治疗组(0.73±0.18)的淋巴细胞增殖均可被抑制,差异具有统计学意义(p0.05)。对于没有P0180-199的刺激,三个组之间也有统计学差异(p0.05)。说明RAD001抑制淋巴细胞增殖反应。4.坐骨神经免疫荧光结果表明,与对照组相比,RAD001预防组和治疗组均显示M2巨噬细胞表型表达升高,M1巨噬细胞表型表达降低(p0.05)。脾单个核细胞流式细胞术分析表明,RAD001预防组和治疗组M2巨噬细胞水平较对照组有明显升高(p0.05)。说明RAD001促进M2巨噬细胞极化。5.RAD001对细胞因子的影响:与对照组相比,一些促炎症因子(IL-1α、IFN-γ、RANTES和IL-17)在蛋白和/或m RNA水平上在RAD001预防组和治疗组表达量明显降低,而抗炎细胞因子(IL-10、TGF-β和IL-4)在蛋白和/或m RNA水平上含量显著增加(p0.05)。但三组中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL 12、IL-13、TNF-α或GM-CSF没有显著区别。研究结论:我们的研究表明,RAD001通过抑制m TOR通路,抑制下游产物,导致p-Akt水平升高,从而造成巨噬细胞向M2型分化增加,缓解EAN症状。RAD001在ENA鼠的抗炎效应,可能与人类GBS相似,可以改善炎性环境,间接起到神经保护作用。因此,RAD001可能是缓解多发性周围神经病的一个候选药物。
【图文】：

31图 1、自身免疫性神经炎大鼠的临床评分和自身免疫性神经炎大鼠坐骨神经的组织病理学检测Fig 1. Clinical score and histopathological analysis of sciatic nerves of EAN ratsRAD001 治疗组与对照组比较使用 Mann-Whitney U tests 完成。在 D 和 F 中比例尺是 10μm。(A) 在 RAD001 预防组和 RAD001 治疗组，大鼠从免疫后 7到16天的临床评分和10到16 天的临床评分显示明显好于对照组(每组在每个时间点分别比较， p < 0.05)。RAD001 预防组、RAD001 治疗组和对照组临床评分的平均峰值分别为 3.20±0.58,3.50±0.22,6.90±0.29(图 1A 和 B), 差异具有统计学意义, p < 0.05。很显然，，在预防治疗组,第一次临床症状的出现被推迟到9.20±0.20天(图 1A 和 C),而这种迹象很快出现在治疗组（免疫后 7.20±0.20 天）和对照组（免疫后 6.80±0.20 天）(图 1 C)。(B-C) RAD001 改善了临床评分的峰值，延迟自身免疫性神经炎大鼠疾病发作的时间。免疫后第 16 天, 我们评估了自身免疫性神经炎大鼠在临床发病高峰期坐骨神经的组织病理学情况。HE 染色(D)用于显

图 2、RAD001 减轻了 EAN 引起的周围神经损伤Figure 2. RAD001 improves peripheral nerve conduction deficits in EAN rats.自身免疫性神经炎大鼠运动神经CMAPs典型的电生理记录是刺激坐骨神经的腓骨头(A)或踝关节(B)诱发出来的，从左至右分别表示的是控制组、依维莫司预防组和治疗组。与对照组比较,RAD001 用药组免受自身免疫性神经炎引起的平均运动神经传导速度(MNCV)的减慢(C)。与对照组相比，RAD001 用药组改善了CMAPs(D)的振幅，同时也表现出更好的CMAPs的远端运动潜伏时 (E)。对照组和 RAD001 治疗组用 Mann-Whitney U 检验比较，数据用均数加减标准差表示(依维莫司治疗组与控制组比较，* p < 0.05;每组 n = 4 )。相似的结果实验重复两次。RAD001-P, preventive RAD001 group; RAD001-T, therapeutic RAD001group。2.3 依维莫司抑制淋巴细胞增殖反应在免疫后第 16 天，无菌条件下取脾脏并提取单个核细胞制成悬液，用P0180-199或无抗原刺激 72 小时后，应用 MTS 方法评估 RAD001 对于 T 细胞增殖
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R745.43

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本文编号：2561649