石胆酸对胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化调控机制的研究

发布时间：2019-11-21 05:56

【摘要】：胶质瘤母细胞瘤是最常见、最具侵袭性的脑肿瘤，其发病率为每年3.17例/100，000人，占原发性脑肿瘤17%，其5年生存率及10年生存率分别为4.5%及2.7%。尽管胶质母细胞瘤的治疗在护理、手术切除、放疗和化疗等领域不断改进，但其中位无进展期及中位生存期仍仅为6.7个月及14.6个月。尽管目前其在手术，放疗和化疗方面目前已有相当大的进展，但胶质母细胞瘤预后并没有得到实质性改善。根据既往研究发现胶质母细胞瘤的预后极差除了其浸润生长方式，其具有免疫抑制表型也是其特征之一。而且，胶质母细胞瘤细胞几乎可耐受不同的凋亡刺激。改变细胞凋亡途径不但促进胶质瘤的发病，而且会促进对传统遗传毒性疗法的耐受，因为目前的治疗方法大多无法有效控制和治疗胶质母细胞瘤，故具有创新性的治疗策略必须得到发展。在过去的几十年中人们已经作出了大量的努力。通过研究发现在生理条件下，虽然胶质母细胞瘤可抵抗受严格调控的凋亡性细胞死亡过程，致使癌细胞的存活率有所提高。然而，细胞凋亡级联反应在胶质母细胞瘤细胞凋亡中扮演重要角色，因此，从诱导肿瘤细胞凋亡角度治疗胶质母细胞瘤成为可能。然而，迄今为止，临床研究都指向靶向治疗途径，显示出的疗效有限。在胶质母细胞瘤治疗中，目前研究高效、低毒性的诱导胶质母细胞凋亡的靶向治疗药物仍然是胶质母细胞瘤研究热点。石胆酸是一种胆汁酸，新近研究发现低浓度的LCA可以使BE(2)-m17和SK-n-MCIXC细胞对过氧化氢诱发的细胞衰亡变得敏感，一定浓度的LCA使人神经元细胞的原始培养物对此类型的细胞死亡具有了一定的抵御能力。在NB细胞系BE(2)-m17和SK-n-MCIXC中，LCA通过与细胞表面紧密结合，启动细胞内级联反应触发细胞内在和外在的细胞衰亡路径，最终导致细胞死亡。LCA与细胞表面紧密结合后，通过激活CASPASE-8引起MOMP，这反过来又会导致MOMP。LCA也会通过cAMP/PKA信号通路刺激TGR5传输MOMP，激活从细胞质膜到线粒体之间的信号。LCA诱发的MOMP可能会导致细胞色素C从线粒体中流出，从而导致衰亡体的形成和所观察到的CASPASE-9活化。CASPASE-9随后会通过酶原-3的蛋白水解过程激活CASPASE-3。CASPASE-3的蛋白水解活化作用也可通过LCA诱发细胞衰亡的外源路径内的CASPASE-8来实现。活化的CASPASE-3通过对蛋白质载体的分解完成LCA驱动型细胞衰亡过程的分解阶段。此外，LCA与细胞表面的紧密结合会引发CASPASE-6的蛋白水解活化作用。该活化作用的机理和LCA驱动型细胞衰亡过程中是否有CASPASE-6的参与仍有待确定。另外，LCA与细胞表面的紧密结合会引起炎症CASPASE-1的抑制。该抑制可能会衰减细胞激素白细胞介素1β和白细胞介素18的产生和分泌，从而阻止B细胞的生长和增殖，这对LCA的抗癌效用会起到一定的效果。并且通过研究发现LCA刺激的TGR5会启动三份子的级联反应，这会触发内在和外在路径的细胞衰亡。首先，它可以通过修改线粒体中的氧化还原过程启动cAMP/PKA信号通路。其次，升高的LCA细胞内ROS响应加剧了囊泡将CD95/Fas死亡受体单体从高尔基体转移向细胞质膜的过程。第三，受LCA刺激的TGR5可以激活MEKK1/2/3-MKK4/7蛋白激酶的级联反应。由于LCA可通过级联反应诱导神经源性肿瘤凋亡，并且一定浓度下具有对正常神经细胞保护作用，故LCA对胶质母细胞瘤抗肿瘤研究具有重要价值，，其作用机制仍需进一步研究。石胆酸可杀死胶质瘤细胞，且不损伤正常神经元细胞。但石胆酸抗胶质瘤的机制目前尚不清楚，尤其是对胶质母细胞瘤有无调控作用尚不可知。既往研究得知不饱和醛类可激活Fas/FasL等细胞凋亡途径，而活性氧（ROS）可通过导致细胞结构和功能损伤，甚至细胞死亡，产生损害作用。质子漏通过脂质过氧化作用回到线粒体基质，限制活性氧产生，导致氧化磷酸化的解偶联发生。脂质过氧化引起自由基变化，生成不饱和醛类，是线粒体信号分子，诱发细胞凋亡，及引起突变诱发肿瘤。故建立不饱和醛线粒体模型，提供和搭建了研究石胆酸作用胶质母细胞瘤的分子机制的方法、桥梁和平台，具有重要研究价值。本研究选择胶质母细胞瘤线粒体为研究对象，采用过氧化氢诱导建立胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化模型，及建立不饱和醛线粒体模型，并在石胆酸干预下检测不饱和醛，探索石胆酸对不饱和醛的调控能力，初步阐明石胆酸通过线粒体抗胶质母细胞瘤的分子机制。结果本研究成功建立了生物活性不饱和醛线粒体模型，并实际应用于石胆酸调控胶质母细胞瘤的体外作用机制的研究。借助2-硫代巴比妥酸与生物活性不饱和醛反应，确定建立最佳模型条件：胶质母细胞瘤线粒体1.5mg/ml，H2O20.6mg/ml，反应时间30min，3.0ml46mM硫代巴比妥酸，检测指标为495nm、450nm和532nm峰变化。根据上述线粒体模型，石胆酸抗不饱和醛调控495nm、450nm和532nm变化的最佳条件为100μM，反应时间为15min和酸性微环境。研究结论为石胆酸通过调控495nm，450nm和532nm峰变化，产生抗胶质母细胞瘤作用。故可以得出石胆酸适宜浓度具有抗胶质母细胞瘤作用，不饱和醛胶质母细胞瘤线粒体模型将成为石胆酸机制研究的有效、快捷实用的平台。反式丁烯醛属于亲水性α, β-不饱和醛，可以通过线粒体脂质过氧化内源性产生，在产生位置高效吸收，然后与DNA反应，形成DNA加合物。反式丁烯醛的生物活性羰基，引起脂质过氧化作用，诱导细胞凋亡并产生致癌作用。其紫外光谱主峰为495nm，故之前研究结论石胆酸通过调控495nm，450nm和532nm峰变化，产生抗胶质母细胞瘤作用，有可能通过调控反式丁烯醛实现。但是目前，在分子水平上，关于石胆酸、反式丁烯醛、胶质母细胞瘤线粒体相互作用研究甚少，涉及相互作用机制报道匮乏。故阐明石胆酸作用于反式丁烯醛的作用及机制具有重要科研价值。因此，我们采用反式丁烯醛为靶标，以紫外可见吸收光谱和拉曼振动光谱媒介，观察石胆酸对反式丁烯醛的紫外可见吸收光谱和拉曼振动光谱变化，奠定石胆酸作为治疗脑胶质母细胞瘤机制基础。一方面，有利于阐明石胆酸对反式丁烯醛调控的分子机制，探究石胆酸作用反式丁烯醛可调谐分子靶点。另一方面，为进一步研究石胆酸抗胶质母细胞瘤分子机制提供理论基础。本研究采用紫外可见吸收检测紫外吸收变化，检测范围400-600nm；采用拉曼振动光谱检测反式丁烯醛振动光谱变化，检测范围在500-2000cm-1。结果发现石胆酸对反式丁烯醛具有调控作用，494nm主峰呈现逐渐下降趋势，具有浓度依赖性，表明羟醛缩合反应发生。拉曼振动光谱检测结果显示：极强带1676cm1和强带1642cm1的呈显著下降趋势，结果显示：石胆酸对反式丁烯醛的分子调控靶点可能位于C=O和C=C。石胆酸对反式丁烯醛的调控特征，为石胆酸具有保护正常神经细胞提供了分子学支持，进一步为石胆酸作为治疗胶质母细胞瘤的新药机制进行解释。故本研究通过紫外可见吸收光谱和拉曼振动光谱检测，提供了石胆酸调控反式丁烯醛的光谱特征。结果表明：石胆酸对反式丁烯醛调控表现在紫外可见吸收光谱主峰（494nm）和拉曼振动光谱1676cm1极强带及1642cm1强带的变化。不同浓度石胆酸明显降低反式丁烯醛含量。石胆酸调控反式丁烯醛靶点是C=O和C=C伸缩振动。石胆酸调控反式丁烯醛的分子机制是降低CHO中氧原子电子云，使CHO保持非激活态，防止共轭双键分子极化作用，影响甲基诱导效应和超共轭效应，本研究结果对石胆酸抗胶质母细胞瘤提供分子学支持，并发现石胆酸调控反式丁烯醛的分子靶点，为治疗胶质母细胞瘤药物研发提供了新的思路。
【图文】：

线粒体,母细胞瘤,醛类,紫外

观察 1 个主峰（495nm）和 2 个肩峰（532nm 和 450。3 个峰均呈剂量反应依赖性特征。线粒体浓度 1.595nm、450nm 和 532nm 峰与线粒体浓度关系，见图 450nm 峰值变化大于 532nm 峰值变化，而主峰 495nl 时更明显。结果表明：当线粒体浓度为 1.5mg/ml 时95nm 峰，可作为线粒体不饱和醛类模型参数。

醛类,紫外,不饱和醛,胶质母细胞瘤

22.40μM。模型中 H2O2对不饱和醛类紫外峰变化的线粒体的影入 H2O2，建立胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化模型实验模型出现 3 个不同的峰，一个主峰（450nm）个较小的肩峰（532nm）。在不同的时间段，3 个峰的钟时，3 个峰变化最明显，随着时间推移，峰的变化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

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