丙戊酸钠联合替莫唑胺对人胶质瘤U251、SHG44细胞的作用及可能机制研究

发布时间：2020-02-19 10:29

【摘要】：目的：本文旨在观察甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）抑制剂丙戊酸钠(VPA)联合抗肿瘤药物替莫唑胺(TMZ)对神经胶质瘤细胞U251、SHG44的体外抗瘤效应；探讨其可能的相关机制。为以TMZ为基础的胶质瘤联合化疗提供实验依据。方法： 1、丙戊酸钠、替莫唑胺单独对U251、SHG44细胞体外作用的研究（1）给药方案：两种胶质瘤细胞分别给以不同浓度的替莫唑胺或丙戊酸钠，并以空白组做为对照。（2）体外培养神经胶质细胞瘤U251、SHG44细胞，培养至80%细胞密度时，按照上述分组给予药物干预，作用48小时，采用MTT比色法检测各组细胞增殖情况变化。选取两种药物的最适浓度进行后续试验。 2、丙戊酸钠联合替莫唑胺对U251、SHG44细胞体外作用的研究（1）实验分组：1.空白对照组；2.替莫唑胺单独用药组；3.丙戊酸钠单独用药组；4.丙戊酸钠和替莫唑胺联合用药组。（2）体外培养U251、SHG44细胞，按照上述分组给药，，作用48小时后，进行以下实验：1.倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；2.MTT比色法检测细胞增殖变化；3.流式检测细胞凋亡变化；4.DAPI染色法荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化。（3）PI染色后流式细胞仪上检测各组细胞周期变化。 3、丙戊酸钠联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤作用的可能机制研究体外培养神经胶质细胞瘤U251细胞，应用Western Blotting法检测各组细胞中E-cadherin、c-Myc及cyclin-D1、capase-3、capase-8、p-53、Bax和Bcl-2的表达。结果： 1、丙戊酸钠、替莫唑胺单独对U251、SHG44细胞体外作用的影响 MTT比色法检测丙戊酸钠、替莫唑胺分别作用后U251、SHG44细胞增殖情况：结果显示，TMZ及VPA对两种胶质瘤细胞生长均有抑制作用，并随着药物浓度的增加，增值速度逐渐下降，呈剂量依赖性。在后续试验中，即VPA与TMZ联合用药时，我们主要是为了利用VPA作用于细胞，抑制MGMT活性，提高胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，故我们选择TMZ的半数抑制浓度即1mmol/l，而VPA选择1mmol/l、2mmol/l的低抑制浓度进行以后的一系列试验。 2、丙戊酸钠联合替莫唑胺对U251、SHG44细胞体外作用的影响 (1)药物干预后，应用倒置相差显微镜观察SHG44细胞形态学变化：1.空白对照组的细胞数目较多，细胞透亮，呈梭形且贴壁生长，折光性好。2.相比对照组，单用替莫唑胺组细胞数量减少，细胞体积缩小、变圆，透亮度及折光性减弱，胞间连接减少；单用丙戊酸钠的两组细胞状态与对照组相比无明显差别。联合用药组较对照组细胞体积缩小、折光性减弱更加明显，并有漂浮细胞出现，培养基浑浊。并随丙戊酸钠浓度增加，细胞形态变化越明显。 (2)MTT比色法检测联合用药对U251、SHG44细胞增殖的影响：结果显示，SHG44细胞替莫唑胺组OD值为：0.86±0.02，丙戊酸钠组OD值分别为0.72±0.03、0.62±0.03，联合用药组OD值分别为0.63±0.03、0.49±0.03；U251细胞替莫唑胺组OD值为0.86±0.07，丙戊酸钠组OD值分别为0.86±0.09、0.66±0.07，联合用药组OD值分别为0.73±0.05、0.50±0.12。与空白对照组相比较，其他各药物干预组OD值均明显降低(p0.01)，表明细胞增殖速度下降；实验结果还表明，相比丙戊酸钠、替莫唑胺单独用药，联合用药使两种细胞的增殖速度更为显著的下降(p0.01)。（3）流式检测药物干预后U251、SHG44细胞凋亡率变化：流式细胞仪检测两组细胞对照组、丙戊酸钠组、替莫唑胺组、联合用药组细胞凋亡率分别为：SHG44细胞：3.3%，4.1%，7.5%，29.4%，53.7%，72.5%；U251细胞：2.7%，3.2%，3.4%，12.0%，29.8%，33.2%。与对照组相比，两种细胞中丙戊酸钠组细胞凋亡不明显，替莫唑胺组细胞的凋亡率显著增加（p0.01)，而联合用药组细胞的凋亡率比明显高于丙戊酸钠组和替莫唑胺组(p0.01)。（4）药物干预后各组细胞经DNA荧光染料DAPI染色，应用荧光显微镜观察细胞核形态变化。DAPI染色的正常细胞核无固缩，呈体积较大的浅染核形态，核内DNA分布相对均匀；若细胞凋亡，凋亡细胞核出现不同程度的固缩，呈致密浓染的深染核形态，核内DNA浓聚，有细胞凋亡的典型特征。本实验染色结果表明，空白对照组和丙戊酸钠组均少有细胞凋亡；替莫唑胺组细胞凋亡数量增多；联合用药组细胞凋亡更加显著。（5）采用PI染色后流式细胞仪上检测SHG44各组细胞周期变化。结果显示，相比对照组（S期19.40%），替莫唑胺组使细胞S期占42.57%（p0.05），联合用药组S期比值增至74.30%（p0.05）；且相对而言，G1期细胞比例由对照组的75.61%降低至替莫唑胺作用后的48.37%（p0.05），而联合用药后这一比例更为显著的降低至25.70%（p0.05）。以上结果说明TMZ作用于胶质瘤细胞后，可使细胞停滞于G1-S期，并且丙戊酸钠能显著增强替莫唑胺对细胞周期的抑制作用。 3、丙戊酸钠联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤细胞作用的可能机制研究 Western Blotting法检测药物作用后U251细胞中E-cadherin、c-Myc及cyclin-D1、capase-3、capase-8、p-53、Bax和Bcl-2的表达情况：与对照组比较，丙戊酸钠组E-cadherin、c-Myc、cyclin-D1、capase-3、capase-8、p53及Bcl-2、Bax表达无明显差别，替莫唑胺组和联合用药组E-cadherin、c-Myc、cyclin-D1、capase-3、capase-8及Bax表达上调，p53、Bcl-2的表达水平下调，联合用药组上述蛋白相应的表达水平变化较替莫唑胺组更为明显。结论： 1、替莫唑胺及丙戊酸钠均能抑制神经胶质瘤细胞瘤U251、SHG44生长，并呈剂量依赖性； 2、丙戊酸钠增强了替莫唑胺对U251、SHG44细胞凋亡形态学变化，更为明显抑制细胞增殖，细胞周期停滞，促进细胞凋亡； 3、丙戊酸钠联合替莫唑胺促进神经胶质细胞瘤U251、SHG44细胞凋亡可能是通过调节多种凋亡相关蛋白的表达水平来实现的。 4、丙戊酸钠增强了神经胶质细胞瘤U251、SHG44细胞对替莫唑胺的化疗敏感性。
【图文】：

化学结构式,多形性成胶质细胞瘤,中枢神经系统肿瘤,治疗原则

多形性成胶质细胞瘤（Glioblastoma multiforme形胶质细胞瘤，是中枢神经系统肿瘤中最普遍的治疗原则是以手术切除为主，术后放、化疗等的理想[2,3]。GBM 的治疗在化疗方面取得了一些新的e, TMZ)（图 1.1）是一种新型抗肿瘤烷化剂[4]，法简便、易于透过血脑屏障、与其他药物没有叠的患者[5]而引起国内外学者的广泛关注。TMZ 衍生物，其口服后可被人体迅速吸收，并且吸收 TMZ 后，其药物作用广泛分布于全身，较，进入脑脊液，在中枢神经系统达到有效的药物药物浓度比接近 30%～40%[7]。

神经胶质细胞瘤

药物干预后神经胶质细胞瘤SHG44细胞形态学变化(×400)
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

【参考文献】