Nesfatin-1对多巴胺能神经元的保护作用及机制探讨

发布时间：2020-02-29 08:52

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是多发于中老年的神经系统退行性疾病,主要病理改变是中脑黑质(substantia nigra, SN)致密带多巴胺(dopamine, DA)能神经元退行性变,从而导致纹状体(striatum, Str)释放的DA减少所致。虽然遗传、环境、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、蛋白质异常聚集等因素均参与PD的发病,但其确切病因尚不清楚。目前PD病人DA能神经元的保护性治疗途径主要包括铁离子去除途径、单胺氧化酶-B抑制途径、神经营养因子补充、抗氧化剂的应用、神经移植、神经节苷脂途径等,但尚无行之有效的治疗办法可以阻止或者延缓DA能神经元的退行性变。因此,深入探讨PD的发病机制,针对PD病因筛选研发更有效的天然或人工合成药物成为PD研究的关键问题之一 Nesfatin-1是2006年发现的一种由82个氨基酸组成的脑肠肽,由胃底的X/A样细胞分泌,其主要功能是抑制摄食和参与能量代谢,新近研究发现它也可以参与调节生殖、应激反应、认知等过程,并与抑郁和焦虑、癫痫的发病有关。目前有研究发现nesfatin-1在大鼠蛛网膜下腔出血和脑外伤中通过抗凋亡机制发挥神经保护作用。由于其与脑肠肽ghrelin都由胃底的X/A样细胞分泌,本课题组的前期研究工作已证实ghrelin对DA能神经元具有神经保护作用,那么,nesfatin-1对DA能神经元是否具有同样的保护作用?为了探讨这一问题,在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin, MPTP)制备的亚急性PD小鼠模型上,通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测了DA及其代谢产物的含量,免疫组织化学和免疫荧光技术观察了DA能神经元及其神经末梢的改变,蛋白免疫印迹法检测了SN区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)含量的改变,观察了nesfatin-1对DA能神经元的保护作用。并进一步在体外培养的DA能细胞系——MES23.5细胞上,应用1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(1-methyl-4-phenylpyridillium ion, MPP+)制备PD的细胞模型,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)法检测细胞存活率,流式细胞术检测线粒体跨膜电位差(mitochondrial transmembrane potential,△ΨM)和caspase-3活性的变化,werstern blot法检测细胞色素C (cytochrome C, Cyt C)含量及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)磷酸化的变化,细胞免疫化学检测细胞核形态学改变,来深入探讨nesfatin-1神经保护作用的机制。结果如下： 1.在MPTP制备的亚急性PD模型小鼠中,Str内DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid, HVA)的含量均降低,分别降低96.61%、85.51%和97.2%(P0.05)。100ng/μL和200ng/μL nesfatin-1预处理后,可拮抗由MPTP导致的DA、DOPAC和HVA含量的下降；400ng/μL nesfatin-1预处理后,可拮抗MPTP导致的DA和HVA含量的下降(P0.05)。 2.在MPTP制备的亚急性PD模型小鼠中,SN区内TH免疫阳性细胞数目减少30%,TH蛋白表达下降37%,与对照组相比,差别有统计学意义(P0.05),同时Str区TH免疫阳性神经纤维末梢减少。100ng/μL,200ng/μL,400ng/μL nesfatin-1预处理可拮抗MPTP造成的DA能神经元损伤,TH免疫阳性神经元数目分别恢复至正常对照组的100%,82%,80%(P0.05),TH蛋白表达分别恢复至正常对照组的100%,98%,95%(P0.05),Str区TH免疫阳性神经纤维末梢增多。 3. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5细胞24小时后,细胞存活率降低至对照组的74.82%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P0.01)。不同浓度的nesfatin-1(10-7～10-13mol/L)预孵育后,可拮抗MPP+引起的细胞存活率的降低,分别为对照组的101.54%、114.39%、120.78%、110.45%、107.15%、107.78%和101.68%。10^9mol/L nesfatin-1的作用最明显。 4. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5细胞24小时后,细胞ΔΨM出现降低(P0.05),而nesfatin-1(10-8和10-9mol/L)预处理后,可拮抗MPP+造成的ΔΨM的下降(P0.05),10-9mol/L nesfatin-1的作用最明显。 5. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5细胞24小时后,细胞线粒体内Cyt C的含量降低,而胞浆中Cyt C含量升高(P0.05)。10-9mol/L nesfatin-1预处理后,可拮抗MPP+造成的Cyt C从线粒体至细胞浆的释放(P0.05)。 6. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5细胞24小时后,能够导致凋亡效应酶caspase-3的激活,caspase-3的活性为对照组的174.78%(P0.05).10-9mol/L nesfatin-1预处理后,可以拮抗MPP+诱发的caspase-3的激活(P0.05)。 7. MPP+(300μmol/L)孵育MES23.5细胞24小时后,细胞出现核的固缩、深染、破裂等凋亡现象,10-9mol/L nesfatin-1预孵育后,上述现象消失。 8.10-9mol/L nesfatin-1预孵育MES23.5细胞能够诱导ERK1/2蛋白磷酸化,30min达到高峰。尽管ERK1/2/MAPK磷酸化的阻滞剂PD98059预孵育30min,能够拮抗nesfatin-1诱导的ERKl/2磷酸化,但不能改变nesfatin-1拮抗MPP+诱导的ΔΨM下降和caspase-3激活的作用。上述结果表明,nesfatin-1对MPTP和MPP+所致的DA能神经元的损伤均有保护作用,其机制可能是通过保护线粒体功能,抑制Cyt C的释放,进一步抑制caspase-3的激活而发挥,而这种保护作用与ERK1/2/MAPK信号通路无关。Nesfaitn-1可以通过抗凋亡功能而发挥对DA能神经元的保护作用,为PD的预防和治疗提供了新的策略,也为探讨nesfatin-1在中枢神经系统的生理作用提供了新的依据。
【图文】：

小鼠,数目,细胞存活率,细胞

结果n ,、口 ‘a ‘ ^ * b ? Ci _ f、耀i2 Nesfatio-1措抗MPTP小鼠SN区TH阳性细胞数目下降、TH蛋白表达降低和Str区TH免疫阳性经纤维末梢的减少ig.2 Nesfatin-l antagonized MPTP-lnduced reduction in the number of TH-positive neurons andTH levels in the SN, as well as TH immunoreactive fibers in the striatumriginal figures showed TH-positive neurons in different groups. B Data showed the numbers -positive neurons in different groups ( *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs MPTP-treated group). ginal figures and statistic data showed TH levels in the SN in different groups determined by Westet (n=6 ’ *P < 0.05 vs control; < 0.05 vs MPTP-treated group). D Original figures showed Tunoreactive fibers in the striatum in different groups, a control group; b MPTP group;TP+Nesfatin-1 (100 ng/|iL); d MPTP+Nesfatin-1 (200 ng/pL); e MPTP+Nesfatin-1 (400 ng/|iL).Nesfatin-l能够括抗MPP+诱导的MES23.5细胞的损伤上述动物实验证明小鼠侧脑室注射nesfatin-l可有效括抗MPTP引起的中脑炓质D经元损伤。为了深入探讨其神经保护作用的机制，在体外培养的DA能细胞MES23.5细胞上，观察了nesfatin-l对神经毒素MPP+引起的DA能细胞损伤的保护。如图3所示，MPPiS育MES23.5细胞24小时后，细胞存活率降低至对照组的74.82%，照组相比，差别有高度统计学意义（尸<0.05)。不同浓度的nesfatin-ll/L)预孵育后，，可诘抗MPP+引起的细胞存活率的降低，分别为对照组的101.54%.39%、120.78%、110.45%、107.15%、107.78%、101.68%。10.9 mol/L nesfatin-l 的21

拮抗,线粒体膜,细胞线粒体,保护作用

结果 A I— M2 =|-—, M2 M2I M1 M1 M1J2 10° 10^ 102 IQS 10? 10° 10^ 10^ 10? 10* 10° 10^ 10^ 1(^ 10*c FlH-i FLH~1§ OmtrcA MPP^ MPT+IO^ mol/L ftefatin-l11~ M2 |[—, M2：M1 f M110? 10^ 103 10? 10? 10^ ICH 10^ 10?aH-1MPPHIO^ mol/L Nesfatin-1 MPP^+ia^? moi/L Nesfatin-lMPPNfiesfatin^l (mol/L)B Control MPP* 1 沪 jQ-g 10加PlI 1m IJZ -k。 -2OL图4 Nesfatin-1拮抗MPP+诱导的AH^M的下降Fig.4 Nesfatin-1 antagonized MPP+-induced reduction in ATM.Changes were found in mitochondrial transmembrane potential (A4^m) with nesfatin-1 pretreatment. MPP+(300 |imol/L) treatment resulted in a A^m decrease assessed by flow cytometry after 24 h exposure.Pre-incubation with nesfatin-1 (10-8 and 10'^ mol/L) abolished these changes. A Fluorometric assays ofA中m. B Statistical analysis. Data are presented as percentage of control (set at 100%). *尸<0.05 comparedwith control, UP < 0.05 compared with MPP+ group. FLl-H, the pulse height of channel 1 (488 nmexcitation and 525 nm emission); Ml , the gate of damaged cells; M2, the gate of normal cells.5. Nesfatin-1能够拮抗MPP+诱导的CytC的释放细胞线粒体的损伤，能够改变线粒体膜的通透性，使位于线粒体膜内侧的CytC释放至胞團内。为了进一步探讨nesfatin-1对细胞的保护作用是否与抑制MPP+引起的Cyt C23
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5

【参考文献】