【摘要】：第一部分 VMAT2基因敲低小鼠帕金森动物模型脑组织外泌体分泌特点分析目的:以VMAT2敲低为遗传背景、MPTP亚急性暴露为诱因的PD模型,通过行为学、组织病理、和分子生物等方法验证模型的可靠性,并比较比较不同组VMAT2基因敲低小鼠模型脑组织外泌体分泌特点方法:将6月龄的VMAT2敲低50%(HT)的C57小鼠及野生型(WT)C57小鼠随机分为MPTP干预组(MPTP30mg/kg,连续腹腔注射1周)与未处理组。通过转棒试验(Rotarod test)及爬杆实验(Pole test)评价运动协调及平衡能力;免疫荧光染色观察黑质致密区TH 阳性神经元、纹状体TH表达水平,以及α-syn、psyn(S129)、泛素、P62的异常聚集;Western blot检测黑质纹状体系统TH、VMAT2等PD相关分子的表达。利用超高速离心法分别提取不同处理组小鼠全脑组织外泌体,利用电镜观察提取物形态;Western blotting验证提取物是否表达特异性阳性标志物CD63、TSG101及阴性标志物calnexin,纳米颗粒跟踪分析仪(Naosight)分析不同处理组小鼠外泌体直径差别,乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定外泌体数目。结果:相较于对照组,MPTP干预后的小鼠爬杆所用时间 延长,停留在转棒的时间缩短,并且VMAT2敲低50%(HT)的小鼠运动功能减退较野生型(WT)小鼠更加明显。Western blot及免疫荧光结果显示,MPTP暴露能够导致野生型及VMAT2敲低50%(HT)小鼠的黑质致密部THp阳性神经元数目减少,纹状体TH表达水平减少,其中VMAT2敲低小鼠减少的更明显,并且,其黑质神经元内oα-syn、psyn(S129)、泛素、p62表达明显增多。采用超高速离心法提取外泌体,电镜下观察呈杯口状;Western blotting证实提取物表达外泌体特异性标志物CD63、TSG101,不表达calnexin;Naosight结果提示所提物质平均直径为62nm,各组直径无明显差异,乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定结果提示VMAT2敲低50%联合MPTP暴露组小鼠全脑组织外泌体含量明显增加。结论:VMAT2敲低50%联合MPTP暴露组小鼠是非常好的PD动物模型,且其全脑组织外泌体含量明显增加。第二部分 VMAT2基因敲低小鼠模型脑组织外泌体生成及释放环节分析及可能的调节机制探讨目的:比较各组小鼠脑组织外泌体生成及释放环节相关蛋白表达差异,及涉及的可能的机制方法:Western blotting、免疫组化及免疫荧光分析小鼠脑组织外泌体生成及释放相关蛋白表达差异;细胞免疫荧光及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)观察蛋白之间的共定位;乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定外泌体数目。结果:Western blotting、免疫组化及免疫荧光结果提示各组小鼠脑组织外泌体生成相关蛋白如CD63和TSG101表达无差异,而释放相关蛋白Rab35在VMAT2敲低50%联合MPTP暴露组小鼠表达明显增加。细胞免疫荧光及,Co-IP结果提示VMAT2与Rab35共定位及存在相互作用。乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定结果表明:VMAT2敲低95%(LO)和VMAT2敲低50%(HT)联合MPTP暴露组小鼠脑组织外泌体分泌都增多。结论:极低表达水平的VMAT2能够增加脑组织外泌体的分泌,其机制可能是通过影响Rab35来调节外泌体的分泌。第三部分 VMAT2基因敲低小鼠模型脑组组外泌体的致病性研究(细胞模型)目的:观察VMAT2基因敲低小鼠模型脑组织外泌体对细胞的影响方法:将不同组脑组织来源外泌体加入SH-SY5Y细胞中,CCK-8测定细胞活力;PKH26标记外泌体,加入SH-SY5Y细胞,分析细胞对各组外泌体的吸收情况;Western blotting、免疫荧光比较不同处理组细胞α-syn、psyn(S129)、α-syn纤维体、P62、泛素等表达差异;结果:SH-SY5Y可以吸收外泌体,各组吸收无明显差异;Western blotting、免疫荧光结果提示:VMAT2敲低50%联合M PTP暴露组小鼠脑组织外泌体加入细胞后,会诱导细胞α-syn、psyn(S129)、α-syn纤维体、P62、泛素等表达升高结论:在MPTP干预下,VMAT2敲低50%(HT)小鼠脑组织外泌体可导致SH-SY5Y细胞PD样损伤。第四部分:VMAT2基因敲低小鼠模型脑组织外泌体的致病性研究(动物模型)目的:观察纹状体立体定向注射VMAT2基因敲低小鼠模型脑组织外泌体后对小鼠的致病作用方法:通过立体定向,在野生型C57小鼠纹状体区置管,间断性注射不同组小鼠脑组织来源外泌体3月;阿朴吗啡皮下注射观察是否有旋转行为,Rotarod及爬杆实验评价运动协调及平衡能力;Western blotting、免疫荧光、免疫组化观察中脑及纹状体TH、α-syn、泛素(ubiqutin)、psyn(S129)、p62、IBA1等表达水平。RT-qPCR测定TNFα、IL-6、IL-1βmRNA表达水平。结果:接受VMAT2敲低50%联合MPTP暴露组脑组织来源外泌体干预的小鼠,阿朴吗啡可诱导出现偏侧旋转行为;Rotarod及爬杆实验显示小鼠运动能力受损,Western blotting、免疫荧光、免疫组化结果提示TH表达减少、而α-syn、psyn(S129)、p62、泛素、IBA1则表达升高。TNFα、IL-6、IL-1βmRNA表达水平升高。结论:立体定向注射VMAT2敲低50%联合MPTP暴露组脑组织来源外泌体能够诱导小鼠出现PD样改变。第五部分:VMAT2基因敲低小鼠模型脑组织来源外泌体致病性的可能机制的研究目的:探究VMAT2基因敲低小鼠模型脑组织来源外泌体致病性的可能机制方法:Western blotting观察各组外泌体α-syn、iNOS、TNFa、IL-6、GFAP、NeuN、IBA1 的含量;Western blotting观察DNAαse、RNAase、Proteinase K、高温分别处理外泌体后对其致病性的影响;通过ELISA比较不同组小鼠脑组织来源外泌体对BV2细胞促炎症因子分泌的影响;Western blotting观察不同组外泌体加入BV2细胞后对NFκB通路的影响;Western blotting观察外泌体与TNFa中和抗体孵育后对BV2细胞NFκB通路的影响。结果:Western blotting结果提示:VMAT2敲低50%(HT)联合MPTP暴露的小鼠脑组织来源外泌体α-syn寡聚体、iNSO、IL6、TNF-α、IBA1含量相较于其他组明显增多,而NeuN、GFAP相较于其他组则减少;经Proteinase K、高温分别处理的外泌体加入细胞后,SH-SY5Y细胞oα-syn表达水平相对DNAase、RNAase处理组明显减少,说明外泌体的致病性与其携带的蛋白密切相关,而与核酸关系不大;ELISA结果发现VMAT2敲低50%(HT)联合MPTP暴露组小鼠脑组织来源外泌体可以显著增加BV2细胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;Western blotting结果提示:VMAT2敲低50%(HT)联合MPTP暴露组小鼠脑组织来源外泌体可以激活BV2细胞N FκB通路,并且是TN Fα依赖的。结论:VMAT2敲低50%(HT)联合MPTP暴露组小鼠脑组织外泌体的致病性主要与其携带的蛋白有关,涉及的机制包括传播致病性α-syn,激活小胶质细胞诱导炎症,NFκB通路参与其中。
【图文】：
384、 同处理 小鼠 质 p-syn (s129) 表达的变化帕金森 ， 型的 я α-syn 的增 ，还 蛋白的 型的 磷酸化 ， К丝氨酸 129 位点 磷酸化 为 见。 实验ж α-syn 磷酸化 ，结果 ：VMAT2 低 50% 在 MPTP ， psyn (S129) 增加、 （ 1-5）
395、 同处理 小鼠 质 P62 表达的变化。 实验研究жж p62 ，，结果 ：VMAT2 低 50% 在 MPTP 亚 ， p62 增加、 型 在 MPTP p62 я 增加、 （ 1-6）。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5
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本文编号：
2589418
