PRRT2变异的致病性及病理机制初步探讨

发布时间：2020-03-21 18:54

【摘要】：PRRT2相关疾病(PRRT2-associated disorders)是以PRRT2基因变异为共同分子基础的一类常染色体显性遗传性疾病,主要包括发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia,PKD)、良性家族性婴儿癫痫(benign familial infantile seizures,BFIS)、婴儿惊厥伴舞蹈手足徐动症(infantile convulsions with choreoathetosis,ICCA)、偏瘫性偏头痛(hemiplegicmigraine,HM)、发作性共济失调(episodicataxia,EA)等。原发性 PKD是PRRT2相关疾病最常见的表型。目前为止,已经发现了 100多种PRRT2变异,包括无义变异、错义变异、小片段插入/缺失、剪切位点变异等。90%以上变异可导致终止密码提前出现,是PRRT2基因最常见的致病变异类型。携带错义变异的病例远远少于携带截短变异的病例,对错义变异蛋白的功能研究也寥寥无几,多数错义变异与PRRT2相关疾病的关系仍不明确,给疾病的诊治带来困难。PRRT2是中枢神经系统特异性表达的膜蛋白,通过调节神经元的突触传递和Na+离子通道功能影响神经元的兴奋性。截短变异导致蛋白表达水平下降,亚细胞定位异常。单倍体剂量不足可能是PRRT2相关疾病发生的病理机制。有研究发现2种错义变异(p.A287T和p.R308C)的蛋白表达下降或弥散到细胞浆中。我们团队前期对另2种错义变异(p.R266W和p.G305R)的研究则未发现这种改变。2016年,我们团队利用PKD患者尿上皮细胞构建了诱导多能干(inducedpluripotentstem,iPS)细胞,但发现该细胞向神经元分化的周期长,分化效率较低。有文献表明,iPS细胞携带其原始体细胞的表观遗传记忆,可能对分化等细胞特性有一定影响。目前报道的PKD患者iPS细胞模型的原始体细胞多为皮肤成纤维细胞。本研究中,我们对2017年12月以前国内外报道的PRRT2错义变异进行细胞功能实验,根据 American Col lege of Medical Genetics and Genomics(ACMG)指南对错义变异位点的性质进行判定。对于PRRT2编码区检测阴性的PKD患者,我们进一步筛查PRRT2调控区域序列的变异,并进行相关的功能实验,以探讨这些变异的致病性。同时,我们从变异蛋白的降解角度对PRRT2致病机制进行初步探索,并培养携带PRRT2热点变异患者的皮肤成纤维细胞,重编程为iPS细胞,为进一步探索PRRT2的病理机制奠定了基础。第一部分PR尺T2错义变异的致病性分析目的:通过体外细胞功能实验,评估PRRT2相关疾病中发现的错义变异的致病性。方法:对2017年12月之前国内外报道的PRRT2错义变异进行系统性文献回顾和总结。构建N端含EGFP的真核表达载体,进行体外细胞转染实验。免疫印迹法观察PRRT2蛋白水平变化,在共聚焦显微镜下观察蛋白亚细胞定位变化。根据ACMG指南分析变异的致病性。结果:PRRT2错义变异共29个。有10个错义变异蛋白同时存在蛋白水平减低和蛋白异位,3个变异仅改变蛋白的细胞膜定位,2个变异仅出现蛋白表达水平减低。经过ACMG分类,有 15 个变异(p.S275F、p.P279L、p.W281R、p.A287T、p.A291V、p.R295Q、p.G305W、p.A306T、p.A306D、p.R308C、p.S317N、p.G323R、p.G323E、p.G324R 和 p.G324E)为可能致病变异,3个变异(p.P138A、p.D147H和p.P216L)为良性变异,3个变异(p.S208Y、p.A214P 和 p.P215R)为可能良性变异,而 8 个变异(p.E177K、p.P216R、p.P216H、p.R266W、p.R266Q、p.G305R、p.R311W 和 p.I327M)为意义未明确变异。结论:在已报道的PRRT2错义变异中,51.7%(15/29)的变异可以导致PRRT2相关疾病。致病性变异主要集中在PRRT2蛋白C端,提示该区域具有重要的生理功能。第二部分PRRT2基因UTR变异在PKD中的作用探讨目的:对P尺RT2编码区检测阴性的PKD患者筛查PRRT2 UTR变异,并探讨其致病性。方法:收集PRRT2编码区测序阴性的PKD病例85例,筛查UTR变异。然后构建包含UTR变异的质粒表达载体,进行细胞转染,利用实时荧光定量PCR检测mRNA水平变化,免疫印迹法检测蛋白水平的改变。结果:在85例先证者中,分别在2例患者的3'UTR检测到了 c.*933AG和c.*978AG杂合变异,5'UTR未检测出异常。体外细胞实验发现,3'UTR可以明显下调mRNA水平,进而下调蛋白的表达。而c.*933AG和c.*978AG变异减弱了 3'UTR的下调能力,在一定程度上调了 PRRT2的mRNA和蛋白水平。结论:PRRT2蛋白功能增加也可能导致疾病的发生。对于PRRT2编码区检测阴性的PKD患者,还需进一步筛查UTR变异。第三部分PRRT2变异蛋白的致病机制初步探索目的:初步探讨PRRT2变异蛋白的致病机制,并建立人成纤维细胞来源的携带PRRT2热点致病变异的iPS细胞模型。方法:将PRRT2热点致病变异及野生型表达载体转染细胞,用蛋白酶体或溶酶体降解抑制剂乳胞素或3-MA分别进行干预,用免疫印迹法检测PRRT2蛋白变化。利用液相色谱-质谱分析联合免疫共沉淀寻找可能参与PRRT2降解的关键蛋白。培养携带PRRT2热点致病变异的人皮肤成纤维细胞,利用仙台病毒重编程试剂盒建立iPS细胞模型,分化为神经元,免疫印迹法检测神经元中PRRT2蛋白水平的改变。结果:乳胞素和3-MA分别干预后,PRRT2变异蛋白增加较野生型蛋白都增多。PRRT2变异蛋白通过蛋白酶体和溶酶体途径降解。PRRT2与E3泛素连接酶AMFR存在相互作用。成功构建携带PRRT2热点致病变异的源于人皮肤成纤维细胞的iPS细胞,并分化为神经元,蛋白水平检测发现PRRT2变异蛋白显著下降。结论:PRRT2变异蛋白降解增多导致蛋白水平的下降。携带PRRT2热点致病变异的源于人皮肤成纤维细胞的iPS细胞是研究PRRT2病理机制的理想模型之一。
【图文】：

错义,变异型,野生型

１．２错义变异对蛋白定位的影响。Ａ、将Ｎ端融合了邋ＥＧＦＰ标签的尸／＾７７野和各变异型表徸载体瞬时转染Ｈｅｌａ细胞，３６邋ｈ后将细胞固定，，用偶联Ａｌｅｘａ邋Ｆｌｕｏｒ邋５９ＷＧＡ染色，在共聚焦显微镜下观察野生型及各变异型的定位。比例尺：５邋ｐｍ。Ｂ、５个细胞的绿色荧光细胞膜与细胞浆的ＩＯＤ比值，以野生型比值为１，数据以平均值准差（ｘ±ｓ）表示，＊＊＊ｐ＜０．００１。逡逑．３．５逦错义变异的致病性再分类逡逑细胞功能实验提示良性变异不改变蛋白水平及细胞定位，在一定程度上也证实了正的ＰＲＲＴ２蛋白表达水平及细胞膜定位对维持其生理功能的重要作用。结合功能实验结果，逡逑们再次对２９个变异进行ＡＣＭＧ分类。结果发现，有１５个变异（ｐ．Ｓ２７５Ｆ、ｐ．Ｐ２７９Ｌ、逡逑．邋Ｗ２８１Ｒ、ｐ．Ａ２８７Ｔ、ｐ．邋Ａ２９１Ｖ、ｐ．Ｒ２９５Ｑ、ｐ．Ｇ３０５邋Ｗ、ｐ．邋Ａ３０６Ｔ、ｐ．邋Ａ３０６Ｄ、ｐ．Ｒ３０８Ｃ、ｐ．Ｓ３１７Ｎ、逡逑．Ｇ３２３Ｒ、ｐ．Ｇ３２３Ｅ、ｐ．Ｇ３２４Ｒ邋和邋ｐ．Ｇ３２４Ｅ）为可能致病变异，３邋个变异（ｐ＿Ｐ１３８Ａ、ｐ．Ｄ１４７Ｈ

示意图,变异型,蛋白结构,野生型

逦意义未明确逡逑注释：结合本研究中的功能实验进行ＡＣＭＧ分类。逡逑我们绘制了抑及乃野生型及２９种变异型基因和蛋白结构模式图（图１．３），用绿色字逡逑体表示良性及可能良性变异，红色表示可能致病变异，黑色表示意义未明确的变异。由图逡逑可知
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741

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