自噬在高碘诱导SH-SY5Y细胞及大鼠海马组织凋亡中的作用研究

发布时间：2020-03-28 03:17

【摘要】：目的:高碘对智力的影响及具体机制目前依然存在争议,本研究旨在阐明高碘的神经毒性效应以及自噬和凋亡在高碘神经毒性中的作用机制。方法:采用体外实验和体内实验相结合的办法,分别建立高碘染毒细胞模型和饮水型高碘暴露动物模型。使用不同浓度的高碘(0、10、20、30 mmol/L KI)作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,运用细胞活性实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测SH-SY5Y细胞活性,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测SH-SY5Y细胞的氧化应激水平,使用荧光双标检测自噬体和自噬溶酶体的形成情况,Hoechst 33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡小体和凋亡率的变化,Western blot法检测SH-SY5Y细胞自噬和凋亡相关标志物的蛋白表达水平,同时检测了使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)与高碘共同处理后SH-SY5Y细胞凋亡水平的变化情况。选择Sprague-Dewley(SD)大鼠作为研究对象,分设对照组(自来水)和3个碘酸钾(KIO_3)染毒剂量组(500、2500、5000μg/L),将雄鼠和雌鼠按1:2的比例合笼,仔鼠出生后针对子代雄鼠分为高碘染毒组和自噬抑制剂3-MA干预组。染毒2个月后称量体重和脑组织重量,计算脑脏器系数,然后利用Morris水迷宫实验检测学习和记忆能力,利用ELISA法检测血清中甲状腺激素水平和氧化应激水平,通过多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验和Western blot法检测高碘染毒后海马组织自噬和凋亡相关标志物的基因和蛋白表达水平;使用自噬干预剂3-MA与高碘共同处理后,检测学习记忆能力以及自噬和凋亡相关蛋白的表达水平。结果:自噬调控高碘诱导的SH-SY5Y细胞凋亡:1)与对照组相比,一定浓度的高碘可以引起SH-SY5Y细胞形态的异常改变,细胞间隙增大,细胞存活率显著降低,还可显著降低SH-SY5Y细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平(P0.05);2)高碘可引起SH-SY5Y细胞自噬体和自噬溶酶体数量的增加以及自噬关键分子微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain3,LC3)、Beclin1和p62/SQSTM1(p62)水平的升高(P0.05),高碘可引起SH-SY5Y细胞凋亡小体数目和凋亡率的增加,上调凋亡关键分子剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase3,Cleaved Caspase-3)、细胞色素c、P53和凋亡底物分子核糖修复酶PARP的水平(P0.05);3)自噬抑制剂3-MA和高碘共同处理SH-SY5Y细胞能够显著上调凋亡关键分子Cleaved Caspase-3的水平,而自噬激活剂雷帕霉素和高碘共同处理能够显著下调凋亡分子Cleaved Caspase-3的水平(P0.05)。抑制自噬对高碘诱导的子代雄鼠海马组织凋亡的作用:1)与对照组相比,高碘长期暴露可明显增加子代大鼠到达平台的潜伏期和游泳路径,并显著降低其在目标象限的时间比例和路径比例,导致子代大鼠的体重、脑组织重量和脑脏器系数降低,高碘可上调大鼠血清丙二醛的表达水平,并能明显下调SOD和GSH的水平(P0.05);2)高碘可引起大鼠海马组织自噬关键分子LC3基因表达水平以及LC3、Beclin1和p62蛋白表达水平的升高(P0.05),高碘可上调凋亡关键基因Caspase-3的表达水平,引起Cleaved Caspase-3和P53的蛋白表达水平升高,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的水平(P0.05);3)自噬抑制剂3-MA和高碘共同处理能明显下调大鼠海马组织自噬关键分子的蛋白表达水平,上调凋亡关键分子标志物的蛋白表达水平(P0.05);与高碘组相比,3-MA和高碘联合处理组大鼠寻找并到达平台的潜伏期和游泳距离均显著降低,在平台所处象限的时间比例和路径比例均显著升高(P0.05)。结论:1)高碘对SH-SY5Y细胞具有毒性作用,可导致该细胞发生氧化应激,高碘可诱导SH-SY5Y细胞发生自噬和凋亡,且自噬可以调控高碘诱导的SH-SY5Y细胞凋亡;2)高碘暴露可引起子代雄鼠的空间学习和记忆能力下降,引起大鼠血清氧化应激水平升高,高碘可干扰子代雄鼠的生长发育,尤其对脑组织影响显著;3)高碘暴露导致子代雄鼠海马组织发生自噬和凋亡,且自噬性死亡和凋亡参与了高碘对子代雄鼠学习记忆能力的损伤,自噬对高碘诱导的大鼠海马组织凋亡具有潜在的抑制作用。
【图文】：

存活率,细胞存活率,统计学,细胞形态

细胞存活率比对照组存活率下降幅度更加明显，但统计学理组与对照组之间细胞存活率差异无统计学意义（P > 0.图 1.1 不同剂量高碘对 SH-SY5Y 细胞形态的影响（n=3）

博士学位论文,细胞存活率,存活率,对照组

不同剂量高碘对SH-SY5Y细胞形态的影响（n=3）
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R741

【参考文献】