维生素D调节ERK信号通路改善大鼠脑缺血后神经功能障碍的机制研究

发布时间：2020-04-03 06:23

【摘要】：目的研究维生素D(vitamin D,VD)对大鼠全脑缺血(global cerebral ischemia,GCI)的神经保护作用,进一步阐明ERK信号通路在VD改善大鼠GCI后神经功能障碍中的作用,从而为GCI治疗提供新的干预措施。方法将130只成年雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham组,n=40)、全脑缺血模型组(GCI组,n=40)、VD治疗组(GCI+VD组,n=40)、p-ERK1/2抑制剂组(GCI+VD+PD98059组,n=5)和溶剂二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组(GCI+VD+DMSO组,n=5)。采用改良四血管闭塞法建立大鼠GCI模型,于缺血后1、3、5、7天通过神经功能缺损评分(Neurological Severity Scores,NSS)和干湿比重法评估各组大鼠神经功能缺损程度和脑组织含水量;于缺血后3天通过HE染色和透射电镜观察各组大鼠海马神经细胞形态和超微结构变化,TUNEL染色检测各组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡情况,应用Western-Blot法、免疫组化染色和免疫荧光染色检测各组大鼠海马组织VDR、p-ERK1/2、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表达变化。结果1神经功能缺损程度:GCI组大鼠在缺血后1、3、5、7天NSS评分与Sham组相比明显升高(P0.05);GCI+VD组大鼠在缺血后3、5、7天NSS评分与GCI组相比明显降低(P0.05)。2脑组织含水量:GCI组大鼠在缺血后1、3、5、7天脑组织含水量与Sham组相比明显升高(P0.05);而GCI+VD组大鼠在缺血后3、5、7天脑组织含水量与GCI组相比明显降低(P0.05)。3 HE染色:Sham组大鼠海马CA1区神经细胞排列整齐,胞浆透明,细胞核呈圆形或椭圆形,染色质分布均匀,核仁清晰,形态接近正常;GCI组大鼠在缺血后3天海马CA1区部分神经细胞排列紊乱,胞体收缩呈三角形或极不规则,胞浆红染,胞核固缩,结构不清;GCI+VD组大鼠在缺血后3天海马CA1区神经细胞变性坏死和缺失的数量、程度均与GCI组相比减轻。4透射电镜:Sham组大鼠海马组织神经细胞的胞核较大、呈圆形或椭圆形,核膜结构清晰、完整,染色质呈细颗粒状均匀分布,胞质内无空泡形成;GCI组大鼠在缺血后3天海马组织神经细胞形态不规则,染色质凝集成块,核膜和细胞器溶解或消失,有空泡形成;GCI+VD组大鼠在缺血后3天海马组织神经细胞损伤与GCI组相比减轻。5 TUNEL染色:Sham组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞零星分布,着色浅淡;GCI组大鼠在缺血后3天海马CA1区TUNEL阳性细胞数与Sham组相比明显升高(P0.05);GCI+VD组大鼠在缺血后3天海马CA1区TUNEL阳性细胞数与GCI组相比明显降低(P0.05)。6 VDR Western-Blot分析:GCI组大鼠在缺血后3天海马组织VDR蛋白表达量与Sham组相比明显升高(P0.05);GCI+VD组大鼠在缺血后3天海马组织VDR蛋白表达量与GCI组相比明显升高(P0.05)。7 Caspase-3、Bcl-2及Bax免疫组化染色:GCI组大鼠在缺血后3天与Sham组相比海马CA1区Caspase-3和Bax免疫阳性细胞数明显增加,Bcl-2免疫阳性细胞数明显减少(P0.05);GCI+VD组大鼠在缺血后3天与GCI组相比海马CA1区Caspase-3和Bax免疫阳性细胞数明显减少,Bcl-2免疫阳性细胞数明显增加(P0.05)。8Cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax Western-Blot分析:GCI组大鼠在缺血后3天与Sham组相比海马组织Cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达量明显升高,Bcl-2蛋白表达量明显降低(P0.05);GCI+VD组大鼠在缺血后3天与GCI组相比海马组织Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达量明显降低(P0.05),Bcl-2蛋白表达量明显升高(P0.05)。9 p-ERK1/2和Neu N的免疫荧光染色:Sham组大鼠海马CA1区p-ERK1/2蛋白表达较低,较少与Neu N阳性细胞共定位;GCI组大鼠在缺血后3天与Sham组相比海马CA1区Neu N阳性细胞明显减少,但p-ERK1/2蛋白表达升高;GCI+VD组在大鼠缺血后3天与GCI组相比海马CA1区p-ERK1/2蛋白表达水平明显升高,且较多与Neu N阳性细胞共定位。10 p-ERK1/2的Western-Blot分析:GCI组大鼠在缺血后3天海马组织p-ERK1/2蛋白表达量与Sham组相比明显升高(P0.05);GCI+VD组大鼠在缺血后3天p-ERK1/2蛋白表达量与GCI组相比明显升高(P0.05)。11引入p-ERK1/2抑制剂PD98059后的Western-Blot分析:GCI+VD+PD98059组大鼠在缺血后3天与GCI+VD+DMSO组相比,海马组织Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达量明显升高,而p-ERK1/2和Bcl-2蛋白表达量明显降低(P0.05)。结论1 VD通过减轻大鼠脑水肿,降低神经功能缺损评分,从而改善大鼠脑缺血后神经功能障碍;2 VD改善大鼠脑缺血后神经功能障碍的分子机制可能与激活ERK信号通路,减少海马神经细胞线粒体凋亡因子有关。
【图文】：

神经功能缺损,功能,检测结果,大鼠

在缺血后 1、3、5、7 天 NSS 评分与 Sham 组相比明显I+VD 组大鼠在缺血后 3、5、7 天 NSS 评分与 GCI 组相0.001, P<0.001）。（见表 1，图 1）表 1 各组大鼠神经功能缺损得分比较（x ±s）e1 Comparison of neurological deficits of rats in each group（x ±s），P<0.05；#：与 GCI 组比，P<0.05。n神经功能缺损得分1d 3d 5d 5 2.40±0.54 2.60±0.55 2.20±0.45 5 13.20±0.84* 11.60±0.89* 10.60±1.14* 95 12.40±0.89* 9.00±1.22*#7.40±0.55*#5303.582 124.584 149.396 <0.001 <0.001 <0.001

脑组织含水量,含水量,检测结果,大鼠

GCI 组大鼠在缺血后 1、3、5、7 天脑组织含水量与 Sham 组相比0.001）；而 GCI+VD 组大鼠在缺血后 3、5、7 天脑组织含水量与降（P 均<0.001）。（见表 2，图 2）表 2 各组大鼠脑组织含水量比较（x ±s）Table2 Comparison of brain water content of rats in each group（x ±s）ham 组比，P<0.05；#：与 GCI 组比，，P<0.05。脑组织含水量（%）1d（n=5） 3d（n=5） 5d（n=5） 7d（n 75.29±0.29 75.48±0.25 75.23±0.25 75.36± 77.30±0.28* 78.35±0.29* 77.48±0.37* 77.37± 组 77.10±0.30* 77.14±0.18*#76.12±0.24*#76.06±072.834 173.975 74.944 62.8<0.001 <0.001 <0.001 <0.0
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743

【参考文献】