自噬在神经干细胞增殖和分化过程中的作用研究

发布时间：2020-04-11 02:30

【摘要】：研究背景神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞,可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等,有研究已经证实NSCs可以定向分化以修复和替代死亡的神经细胞,用于移植治疗神经系统退行性疾病,但其增殖和分化过程的调控因素尚不清楚。自噬是指在营养缺乏或者受到外界应激情况下细胞降解自身的一些成分获得营养存活下来的机制。研究发现,自噬是细胞内蛋白降解的主要途径之一,有利于胞浆成分和细胞器的更新,主要降解内源性长寿命蛋白及蛋白聚集体,还可降解受损伤的细胞器,从而为细胞生长提供氨基酸、ATP等物质。自噬被认为是细胞适应饥饿的一种方式,也被认为在细胞质组分正常更新中起着重要的作用,特别在神经系统中,自噬对神经退行性疾病起到保护作用。在干细胞分化过程中,存在调控干细胞特性的蛋白被降解,而具有分化细胞特性的蛋白质被生成的过程,自噬作为细胞降解内源性蛋白质的一种机制参与到增殖分化的过程中。目前较多的研究集中在肿瘤干细胞的自噬上,而NSCs的自噬水平研究还比较少见,有文献报道神经前体细胞表达一定的自噬水平,而神经分化能激活自噬。Fonseca MB等发现采用药物降低自噬水平能够降低Aβ诱导的NSCs定向分化,这表明自噬可能在NSCs分化过程中起到一定的作用,但是自噬究竟在NSCs增殖分化过程中起到什么样的作用尚不清楚。Notch1信号通路在胚胎发生和干细胞增殖、分化以及干细胞干性的维持方面起着细胞通讯的作用,在中枢神经系统中Notch1信号参与了NSCs的增殖和分化过程。有研究发现Notch1信号受到自噬水平的调控。因此,为了探明NSCs增殖分化过程中自噬的作用和机制,我们检测在NSCs分化不同时间点自噬水平的变化,并且用药物分别诱导和抑制NSCs自噬水平,检测不同自噬水平对NSCs增殖和凋亡的影响,并对其中的机制进行了探讨,检测了Notch1的表达水平。研究目的本实验设计旨在研究NSCs分化过程中自噬水平的变化及自噬水平变化对NSCs增殖和凋亡的影响及机制,为NSCs应用于临床提供更深入的理论基础。方法1.NSCs的分离及培养:取新生C57BL/6小鼠海马组织进行原代培养,每三天半量换液。神经球长至200μm左右时进行传代,采用Accutase酶原液+机械吹打法进行传代。2.采用免疫细胞化学和流式细胞术对NSCs进行鉴定:神经球贴片后,经NSCs特异性标记物巢蛋白(Neuroepithelial stem cell protein,Nestin)抗体免疫荧光染色,倒置荧光显微镜下观察。流式细胞术检测NSCs中Nestin阳性细胞百分比。3.NSCs分化过程中自噬水平的测定:采用Western blot技术检测NSC分化过程中第0天、1天、3天、7天自噬标记性蛋白微管相关蛋白1的轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达变化情况。4.NSCs分别经1μM、5μM、10μM雷帕霉素(Rapamycin,RPM)和10μM、30μM氯喹(Chloroquine,CQ)处理24小时,采用Western blot检测NSCs中LC3的表达变化。5.NSCs分别经RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)处理24小时后,采用流式细胞术检测细胞周期、Ki-67、Caspase-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3)的表达情况。6.NSCs分别经RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)处理24小时后,流式细胞术检测Notch1的表达变化情况。7.统计学处理。使用SPSS21.0统计软件对数据进行分析处理,采用均数±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析和t检验检测组间差异,以P0.05为差异有统计学意义。实验结果1.体外成功培养新生的C57BL/6小鼠海马区NSCs,新鲜分离的细胞为单细胞状态,3天后开始形成神经球,20天左右进行传代,之后6天传代一次。2.NSCs的鉴定:免疫荧光染色结果表明第三代神经球表达NSCs特异性标记物Nestin,流式细胞术检测Nestin阳性细胞百分比为95%以上。3.Western blot检测结果显示LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在NSCs分化第1天先升高之后开始降低,其中分化第1天和第0天相比LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值有显著性差异(**P0.01)。和第0天相比,分化第3天和第7天的差异无统计学意义(P0.05)。4.Western blot结果显示NSCs中加入RPM(μM:1、5、10)后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值随着RPM浓度的升高而增加,与对照组相比差异具有统计学意义(#P0.05,~(##)P0.01);NSCs经CQ(μM:10、30)刺激后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值也随着刺激浓度的升高而增加,与对照组相比差异具有统计学意义(*P0.05,~(**)P0.01)。5.流式细胞术检测细胞周期结果和Ki-67结果:NSCs经RPM(μM:1、5、10)处理24小时后,S+G2M期的比例随着RPM浓度的升高而降低,其中1μM、5μM和10μM RPM处理组的细胞S+G2M期的比例分别为42.23±1.08%、40.48±0.38%、25.35±1.18%,和对照组44.97±0.78%相比具有显著性差异(~*P0.05,~(***)P0.001),经CQ(μM:10、30)处理后,S+G2M期的比例与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。Ki-67的阳性细胞百分比随着RPM浓度的升高而降低,其中5μM和10μM RPM处理组Ki-67的阳性细胞百分比分别为26.60±7.13%和21.53±6.46%,和对照组33.87±1.01%相比具有显著性差异(~*P0.05),CQ组和对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。6.流式细胞术检测Caspase-3表达水平:NSCs经RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)处理24h后,Caspase-3平均荧光强度随着RPM浓度的升高而升高,其中10μM RPM处理组Caspase-3平均荧光强度为754.67±75.18,与对照组592.33±25.42相比差异具有统计学意义(~*P0.05),CQ处理组和对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。7.流式细胞术检测Notch1表达水平:NSCs经RPM(μM:1、5、10)和CQ(μM:10、30)处理24h后,Notch1平均荧光强度随着RPM浓度的升高而降低,其中5μM、10μM RPM处理组Notch1平均荧光强度分别为5354.67±146.5、3775.67±139.61与对照组6186.33±246.07相比差异具有统计学意义(~(**)P0.01,~(***)P0.001),CQ处理组和对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。结论1 NSCs在分化过程中自噬水平先升高后降低。2自噬水平增加抑制NSCs的增殖,促进了NSCs的凋亡,这可能与Notch1的表达降低有关。
【图文】：

原代培养,细胞碎片,圆球,细胞增殖

观察发现神经球增殖迅速，直径增加，可至 200μm 左右（图3.1C）。NSCs 传代后，培养基中细胞碎片减少，细胞增殖良好（图 3.1D）。当NSCs 传至第三代时，消化后为单个透明圆球状的 NSCs，可以用于后续实验。（3.1E）。

流式,流式细胞术,荧光,免疫细胞

15荧光，Nestin蛋白发红色荧光（图3.2A）。结果表明体外培养的神经球表达 Nestin蛋白。进一步用流式细胞术检测NSCs的阳性细胞百分比为95%以上。表明我们采用的培养方法可以培养出高纯度的NSCs。图 3.2 免疫荧光和流式细胞术对海马区 NSCs 进行鉴定和纯度检测A 为免疫细胞荧光图，B 为流式对照，C 为NSCs Nestin阳性细胞百分比流式检测结果，其中B、C 图的横坐标为PE的荧光强度。Scale bar=50μm3.3 NSCs 的分化在倒置显微镜下观察发现NSCs分化第0d（图3.3.1A），细胞大多处于单细胞状态，，细胞圆形透明，折光度好。分化第1d（图3.3.1B）多数细胞已经开始贴壁，细胞由圆形变成扁平状，开始有突起的形成。分化第3d（图3.3.1C）和第1d相比
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741

【参考文献】