AQP4在星形胶质细胞低糖性水肿中的作用及机制研究

发布时间：2017-03-23 03:16

  本文关键词：AQP4在星形胶质细胞低糖性水肿中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在星形胶质细胞低血糖性水肿中所起的作用及其相关作用机制。方法:(1)在严重低血糖条件下(0.2m M葡萄糖)检测原代星形胶质细胞和星形胶质细胞系CTX-TNA2细胞体积的变化情况;(2)检测原代星形胶质细胞和CTX-TNA2星形胶质细胞中水通道蛋白4的表达情况;(3)构建带EGFP标签的野生型AQP4并转染至CTX-TNA2细胞中,建立表达AQP4蛋白的细胞模型,同时予以低血糖(0.2m M葡萄糖)干预,24小时后观察表达AQP4细胞体积的变化情况;(4)使用AQP4 Si RNA抑制原代星形胶质细胞AQP4的表达,予以上述处理后比较低血糖时AQP4抑制组和对照组细胞体积的变化情况,进一步验证实验结果;(5)构建突变型p EGFP-C2-AQP4-M23质粒:S111A和S180A,检测这两种突变型蛋白在低血糖性细胞水肿中的作用效果。所收集的实验数据使用SPSS Statistics 16.0对结果进行统计学分析。结果:(1)在长时间严重低血糖条件下原代星形胶质细胞出现细胞水肿,而CTX TNA细胞无此现象;(2)原代星形胶质细胞表达水通道蛋白4而CTX-TNA2细胞系不表达;(3)CTX-TNA2细胞转染AQP4-EGFP质粒后24小时可见绿色荧光蛋白表达,并可被特异性的AQP4抗体所识别,成功构建了AQP4示踪系统;同时,在严重低血糖条件下,过表达AQP4的CTX-TNA2细胞与野生型CTX-TNA2细胞相比细胞体积明显变大;(4)抑制原代星形胶质细胞AQP4蛋白的表达后低血糖条件下细胞水肿的现象消失;(5)低血糖处理24h后,表达野生型AQP4和S180A突变AQP4的CTX-TNA2细胞体积明显大于对照组,而表达S111A型AQP4蛋白的细胞体积与对照组无明显差别。结论:低血糖性星形胶质细胞水肿的形成过程中需要AQP4的参与,在这一过程中AQP4蛋白的第111位丝氨酸活化起到了关键作用。
【关键词】：水通道蛋白4 绿色荧光蛋白 低血糖 脑水肿
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R747.9
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 英文缩略语7-13
• 1 前言13-20
• 1.1 低血糖性脑损伤13-17
• 1.1.1 认知障碍15
• 1.1.2 癫痫15-16
• 1.1.3 昏迷与脑水肿16-17
• 1.2 星形胶质细胞在脑水肿形成中的作用17-18
• 1.3 研究内容及意义18-20
• 2 材料与方法20-47
• 2.1 实验材料20-23
• 2.1.1 实验动物与细胞系20
• 2.1.2 载体质粒20-21
• 2.1.3 主要实验试剂21-22
• 2.1.4 主要实验器械和仪器22-23
• 2.2 主要试剂的配置23-25
• 2.3 采用主要软件25-26
• 2.4 实验方法26-47
• 2.4.1 分离及培养原代星形胶质细胞26
• 2.4.2 CTX TNA2细胞的培养与传代26-27
• 2.4.3 低血糖时AST和CTX TNA2星形胶质细胞体积的检测27-28
• 2.4.4 AQP4在AST和CTX TNA2星形胶质细胞中的表达28-30
• 2.4.5 提取大鼠脑部组织总RNA30-31
• 2.4.6 AQP4目的基因的扩增31-35
• 2.4.6.1 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR反应）过程(参考ReverTra Ace qPCR RT Kit说明书)31
• 2.4.6.2 巢式PCR反应过程31-34
• 2.4.6.3 PCR反应产物的提取与纯化34-35
• 2.4.7 pEGFP-C2-AQP4-M23重组质粒的构建35-36
• 2.4.8 转化DH5α 感受态细胞36-37
• 2.4.9 单克隆细菌菌落的挑取与培养37
• 2.4.10 质粒的提取与纯化37-38
• 2.4.11 pEGFP-C2-AQP4-M23重组质粒的鉴定38-40
• 2.4.11.1 酶切鉴定38-39
• 2.4.11.2 pEGFP-C2-AQP4-M23重组质粒转染 293T细胞，检测AQP4蛋白的表达情况39-40
• 2.4.12 低血糖时水通道蛋白4对星形胶质细胞体积的影响40-41
• 2.4.13 抑制水通道蛋白4对低血糖性星形胶质细胞水肿的影响41-42
• 2.4.13.1 原代星形胶质细胞的准备41
• 2.4.13.2 转染AQP4 siRNA抑制原代星形胶质细胞中AQP4的表达41-42
• 2.4.13.3 实验分组和低血糖条件处理42
• 2.4.14 AQP4介导低血糖性星形胶质细胞水肿的作用位点的研究42-45
• 2.4.14.1 构建AQP4 M23突变体42-44
• 2.4.14.2 转化DH5α 感受态细胞44
• 2.4.14.3 单克隆细菌菌落的挑取与培养44-45
• 2.4.14.4 S111A-AQP4 M23和S180A-AQP4 M23突变质粒的提取与纯化45
• 2.4.14.5 S111A-AQP4 M23和S180A-AQP4 M23突变质粒的测序鉴定45
• 2.4.15 AQP4蛋白第111位和第180位丝氨酸磷酸化对低血糖时星形胶质细胞水肿形成的影响45-47
• 3 实验结果47-68
• 3.1 低血糖时原代星形胶质细胞（AST）体积增大而星形胶质细胞系（CTX TNA2）体积未发生变化47-49
• 3.1.1 原代星形胶质细胞低血糖时的细胞体积变化48-49
• 3.1.1.1 细胞形态变化48
• 3.1.1.2 细胞体积的统计学结果48-49
• 3.1.2 星形胶质细胞系（CTX TNA2）低血糖时的细胞体积变化49
• 3.1.2.1 细胞形态变化49
• 3.1.2.2 细胞体积的统计学结果49
• 3.2 水通道蛋白4在AST细胞中有明显表达，，而在CTX TNA2星形胶质细胞中没有表达49-51
• 3.2.1 细胞免疫荧光结果50
• 3.2.2 Western Blot实验结果50-51
• 3.3 大鼠脑部组织总RNA的浓度与纯度检测51
• 3.4 AQP4目的片段扩增产物的获得51-52
• 3.5 pEGFP-C2-AQP4-M23重组质粒的鉴定结果初步表明质粒构建成功52-56
• 3.5.1 酶切鉴定结果52-54
• 3.5.2 pEGFP-C2-AQP4-M23重组质粒测序结果显示表达质粒构建成功54-55
• 3.5.3 荧光显微镜检测转染效果显示表达质粒能够成功表达绿荧光蛋白55-56
• 3.5.4 Western Blot结果显示重组质粒可以成功表达AQP4蛋白56
• 3.6 重组质粒pEGFP-C2-AQP4-M23在CTX TNA2细胞中的表达与定位56-58
• 3.7 转染AQP4的CTX TNA2细胞在低血糖诱导条件下发生细胞水肿58-59
• 3.7.1 LSCM扫描图像结果58-59
• 3.7.2 细胞体积的统计学分析59
• 3.8 抑制原代星形胶质细胞AQP4的表达后低血糖引起星形胶质细胞水肿的现象消失59-64
• 3.8.1 时间对AQP4 SiRNA抑制AQP4蛋白表达效果的影响59-60
• 3.8.2 抑制原代星形胶质细胞AQP4的表达后低血糖时星形胶质细胞的体积变化60-64
• 3.8.2.1 低血糖条件下转染AQP4 SiRNA的原代星形胶质细胞表达AQP4蛋白情况60-61
• 3.8.2.2 低血糖条件下转染AQP4 SiRNA的原代星形胶质细胞形态变化61-62
• 3.8.2.3 抑制原代星形胶质细胞AQP4蛋白的表达后，低血糖条件下细胞体积无明显变化62-64
• 3.9 AQP4介导低血糖性星形胶质细胞水肿的作用位点为111位丝氨酸64-68
• 3.9.1 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突变体的构建64-65
• 3.9.2 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突变体对低血糖性星形胶质细胞水肿形成的影响65-68
• 3.9.2.1 S111A AQP4 M23和S180A AQP4 M23突变体对低血糖性星形胶质细胞形态变化的影响65-66
• 3.9.2.2 各组细胞体积的统计学分析66-68
• 4 讨论68-73
• 5 结论与展望73-74
• 6 参考文献74-78
• 致谢78-79
• 学术论文和科研成果目录79
• 学术论文79
• 专利79

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