M2型巨噬细胞参与星形胶质细胞胶质瘢痕形成的分子机制

发布时间：2020-04-18 10:20

【摘要】：目的:研究M2型巨噬细胞通过分泌转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)是星形胶质细胞(astrocytes,AS)活化致胶质瘢痕形成的内在机制,为进一步探寻中枢神经系统损伤后胶质瘢痕形成的机制以及治疗新策略研究提供理论和实验依据。方法:(1)大鼠AS的分离、培养与鉴定:新生(3天)SD乳鼠10只,麻醉处死,迅速取出脊髓,解剖镜下剥除脊髓外膜,剪碎后的脊髓组织采用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液,差速贴壁法纯化AS;采用免疫化学发光法检测第3代AS的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达作为细胞纯度鉴定,P3代AS用于后续实验。(2)大鼠骨髓巨噬细胞(Mφ)的分离、培养与诱导分化为M2型巨噬细胞:SD大鼠5只(200-250 g),10%水合氯醛麻醉处死(0.4 mL/100 g),无菌环境下取出下肢股骨和胫骨的骨髓细胞,用含20%L929细胞条件培养基(L929-CM)、15%FBS的RPMI-1640培养基培养7天,获得纯化的M0型巨噬细胞;于培养第8天加入IL-4(20 ng/ml)和IL-10(20 ng/ml)诱导培养24 h,可得到M2型巨噬细胞;采用流式细胞术对M2型巨噬细胞的CD11b、CD206、Arg-1和iNOS表达进行表型鉴定。(3)M2型巨噬细胞与AS间接共培养及相关检测分析:利用0.4μm孔径的Transwell 6孔板共培养,上室为巨噬细胞,下室为AS,2种细胞接种的细胞数均为1×10~5个/孔。实验分为以下4组:M2型巨噬细胞+AS组,M2型巨噬细胞+TGF-β受体阻断剂+AS组(TGF-β受体阻断剂SB431542终浓度为100mmol/L),M2型巨噬细胞单纯培养组和AS单纯培养组。共培养48 h后采用荧光定量PCR(q-PCR)检测各组M2型巨噬细胞TGF-β和血小板衍生因子(platelet derived growth factor,PDGF)以及各组AS细胞的GFAP、硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)(Neurocan)、IL-4和IL-13基因的mRNA表达变化;Western blot检测各组AS的GFAP及CSPG(Neurocan)的蛋白表达情况;ELISA检测各组细胞培养上清液中TGF-β的含量。结果:(1)免疫荧光检测结果表明,分离培养的大鼠脊髓AS细胞胞浆中高表达GFAP,培养的P3代AS细胞的GFAP阳性表达细胞百分比高达(95.86±1.02)%。(2)流式细胞术鉴定结果表明,分离诱导的M2型细胞高表达CD11b、CD206和Arg-1,低表达iNOS,符合M2型巨噬细胞的表型特征。(3)q-PCR检测结果显示,M2型巨噬细胞+AS共培养组较单纯AS细胞培养组中AS的GFAP、CSPG(Neurocan)和IL-13在基因表达水平均上调(P值均㩳0.05),IL-4表达无差异(P㧐0.05),且共培养组中M2型巨噬细胞TGF-β和PDGF的基因表达较单纯M2型巨噬细胞培养组均明显上调(P值均㩳0.05);但M2型巨噬细胞+TGF-β受体阻断剂+AS组中AS的GFAP、CSPG(Neurocan)和IL-13表达水平低于M2型巨噬细胞+AS组(P值均㩳0.05),且前者中M2型巨噬细胞TGF-β和PDGF的基因表达较后者均明显下调(P值均㩳0.05)。(4)Western blot检测显示,M2型巨噬细胞+AS组和M2型巨噬细胞+TGF-β受体阻断剂+AS组中AS的GFAP和CSPG(Neurocan)在蛋白表达水平较单纯AS培养组上调(P值均㩳0.05);但后者(含TGF-β受体阻断剂组)中AS的GFAP和CSPG(Neurocan)表达水平低于前者(P值均㩳0.05)。(5)ELISA检测结果显示,M2型巨噬细胞分泌TGF-β的能力显著高于AS;与M2组相比,M2+AS组和M2+TGF-βR阻断剂+AS组培养上清液中TGF-β的浓度显著升高;与M2+AS组相比,加有TGF-βR阻断剂的共培养组上清液中TGF-β的浓度明显下调(P值均㩳0.01)。结论:本研究通过体外实验探讨了大鼠来源M2型巨噬细胞对脊髓星形胶质细胞的致纤维化作用,并初步阐明M2型巨噬细胞分泌TGF-β是活化星形胶质细胞致胶质瘢痕形成的内在机制,这为进一步探寻中枢神经系统损伤后的胶质瘢痕形成的机制的研究和今后抗胶质瘢痕治疗新靶点的临床转化应用奠定实验依据。
【图文】：

免疫荧光染色,双色图,分离培养,大鼠

21图 1 分离培养的 AS 形态及免疫荧光染色鉴定注：A：培养 3 d 的 AS（×40）；B：培养 7 d 的 AS（×40）；C：P1 代 AS（×40）；D：P2代 AS（×40）；E：DAPI 细胞核染色（×100）；F：纯化的大鼠 AS 经 GFAP 免疫荧光染色呈强阳性（×100）；G：E、F 重叠双色图片（×100）。2.2 M2 型巨噬细胞免疫表型检测结果经流式细胞术检测表明本实验诱导培养的 M2 型巨噬细胞高表达 CD11b、CD206 和 Arg-1，低表达 iNOS，符合 M2 型巨噬细胞表型，，可用于后续实验。

巨噬细胞,共培养,无差异,抑制剂

共培养后M2型巨噬细胞与AS基因表达变化
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

【参考文献】