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RNF213基因对烟雾病相关致病因子作用的研究

发布时间:2017-03-23 13:10

  本文关键词:RNF213基因对烟雾病相关致病因子作用的研究,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:目的:探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)中RNF213基因对VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9基因表达的影响,明确RNF213基因量变在烟雾病发病过程中的作用。内容:收集济宁医学院附属医院神经外科和神经内科2014年9月至2015年4月间入院的烟雾病患者以及体检中心健康人的血清,用Elisa方法分别检测烟雾病患者组以及健康人对照组血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的含量,比较两组间相关因子含量的差异。分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞以达到纯化的目的,应用流式细胞术和成骨、成脂诱导分化进行鉴定。分别将RNF213-shRNA和Negative-shRNA慢病毒重组质粒转染第3代rBMSCs,通过RT-qPCR技术检测RNF213-shRNA对VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA表达的影响。方法:通过酶联免疫吸附实验(Elisa)方法检测烟雾病组和健康人对照组血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的含量,用SPSS19.0分析两者血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9表达量的差异。应用全骨髓贴壁法分离、培养rBMSCs进行纯化,并通过流式细胞术和成骨、成脂方向诱导分化对纯化后的第3代rBMSCs进行鉴定。选用第3代rBMSCs作为细胞实验对象,分别将RNF213-shRNA和Negative-shRNA慢病毒重组质粒对第3代细胞进行转染,将实验分为A组(转染RNF213-shRNA慢病毒的rBMSCs组)、B组(转染Negative-shRNA慢病毒的rBMSCs组)、C组(未转染的rBMSCs组),应用RT-qPCR技术检测慢病毒的转染效率以及三组rBMSCs转染慢病毒7天和15天时VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA的表达情况。结果:1.与健康人对照组相比,烟雾病组血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的表达水平均明显升高,两组间差别具有统计学意义(P0.05)。2.分离纯化的第3代rBMSCs细胞表面高表达CD90(95.15%)和CD44(99.23%),低表达CD45(0.74%)。成骨诱导21天后,用茜素红进行染色,可见明显的红色致密钙化结节;成脂诱导14天后,用油红O进行染色,可见胞内大量红色脂滴形成。3.RNF213-shRNA慢病毒转染效率鉴定结果显示:相对于C组(未转染rBMSCs组),A组、B组RNF213 mRNA的相对表达量分别为0.028±0.002、0.976±0.021,两组之间相对表达量的差别具有统计学意义(P0.01)。4.转染后第7天RT-qPCR结果显示:相对于C组,A组、B组VEGF mRNA的相对表达量分别为0.915±0.112、0.949±0.012,两组之间相对表达量的差别无统计学意义(P0.05);A组、B组bFGF mRNA的相对表达量分别为0.964±0.023、0.958±0.035,两组之间相对表达量的差别无统计学意义(P0.05);A组、B组TGF-β1mRNA的相对表达量分别为3.269±0.968、0.996±0.005,两组之间相对表达量的差别具有统计学意义(P0.01);A组、B组MMP-9 mRNA的相对表达量分别为3.147±0.320、0.946±0.052,两组之间相对表达量的差别具有统计学意义(P0.01)。5.转染后第14天RT-qPCR结果显示:相对于C组,A组、B组VEGF mRNA的相对表达量分别为0.973±0.019、0.966±0.026,两组之间相对表达量的差别无统计学意义(P0.05);A组、B组bFGF mRNA的相对表达量分别为1.582±0.272、0.966±0.039,两组之间相对表达量的差别具有统计学意义(P0.01);A组、B组TGF-β1 mRNA的相对表达量分别为2.370±0.068、0.974±0.019,两组之间相对表达量的差别具有统计学意义(P0.01);A组、B组MMP-9 mRNA的相对表达量分别为2.741±0.374、0.976±0.044,两组之间相对表达量的差别具有统计学意义(P0.01)。结论:1.相对于健康人对照组,烟雾病组血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的表达水平均明显升高,说明VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9在烟雾病的发生发展过程中可能发挥了重要作用。2.利用全骨髓贴壁法可成功分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,第3代细胞可作为后续细胞实验良好的种子细胞。3.RNF213-shRNA可有效抑制rBMSCs中RNF213基因的表达,RNF213基因的低表达可诱导bFGF、TGF-β1、MMP-9基因的高表达。4.RNF213基因可能通过某种基因通路影响bFGF、TGF-β1、MMP-9基因的表达,从而使烟雾病患者体内bFGF、TGF-β1、MMP-9表达异常,说明RNF213基因量变在烟雾病发生发展过程中可能发挥了重要作用。
【关键词】:烟雾病 RNF213 骨髓间充质干细胞 血管内皮生长因子 碱性成纤维生长因子 转化生长因子 β1 基质金属蛋白酶 9
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R743
【目录】:
  • 中文摘要4-6
  • Abstract6-11
  • 缩略语/符号说明11-12
  • 前言12-17
  • 研究现状、成果12-15
  • 研究目的、方法15-17
  • 一、烟雾病患者血清中相关因子的表达17-26
  • 1.1 对象和方法17-20
  • 1.1.1 研究对象17-18
  • 1.1.2 实验试剂和耗材18
  • 1.1.3 实验仪器18-19
  • 1.1.4 研究方法19
  • 1.1.5 数据处理19-20
  • 1.2 结果20-23
  • 1.3 讨论23-25
  • 1.4 小结25-26
  • 二、骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定26-37
  • 2.1 对象和方法26-30
  • 2.1.1 研究对象26
  • 2.1.2 实验试剂和耗材26-27
  • 2.1.3 实验仪器27
  • 2.1.4 研究方法27-30
  • 2.1.5 数据处理30
  • 2.2 结果30-34
  • 2.2.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养及形态学特征30-31
  • 2.2.2 骨髓间充质干细胞传代细胞成活率测定31
  • 2.2.3 骨髓间充质干细胞传代细胞贴壁率测定31
  • 2.2.4 骨髓间充质干细胞生长曲线测定31
  • 2.2.5 流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞31
  • 2.2.6 成骨诱导分化鉴定骨髓间充质干细胞31-32
  • 2.2.7 成脂诱导分化鉴定骨髓间充质干细胞32-34
  • 2.3 讨论34-36
  • 2.4 小结36-37
  • 三、RNF213-shRNA转染与相关因子mRNA表达检测37-49
  • 3.1 对象和方法37-40
  • 3.1.1 实验试剂37-38
  • 3.1.2 实验仪器38
  • 3.1.3 实验分组38
  • 3.1.4 转染方法38
  • 3.1.5 RT-qPCR检测转染效率38-40
  • 3.1.6 RT-qPCR检测细胞内相关因子mRNA表达的变化40
  • 3.1.7 数据处理40
  • 3.2 结果40-44
  • 3.2.1 RNF213-shRNA对RNF213 mRNA表达的影响40-41
  • 3.2.2 RNF213-shRNA对细胞内相关因子mRNA表达的影响41-44
  • 3.3 讨论44-48
  • 3.3.1 RNA干扰技术与慢病毒载体44-45
  • 3.3.2 RNF213基因与烟雾病45-48
  • 3.4 小结48-49
  • 结论49-51
  • 参考文献51-56
  • 发表论文和参加科研情况说明56-57
  • 综述 烟雾病病因及发病机制的研究进展57-65
  • 综述参考文献62-65
  • 致谢65-66
  • 个人简历66

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本文编号:263790


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