探究树突状细胞自噬在胸腺瘤合并MG组织及Thy0517共培养下的表达作用

发布时间：2020-04-24 05:59

【摘要】：背景:胸腺瘤是最常见的前纵隔肿瘤,常合并重症肌无力(myasthenia gravis,MG)、系统性红斑狼疮、干燥综合征等多种自身免疫疾病。MG是乙酰胆碱受体抗体介导的,细胞免疫依赖及补体参与的神经-肌肉接头处传递障碍的自身免疫性疾病,约35-70%胸腺瘤患者伴有MG并且15%的MG患者伴有胸腺瘤。树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞,DCs的数量与许多肿瘤的发生发展中的免疫机制密切相关。在重症肌无力患者与单纯胸腺瘤或者正常人群对比中,同样发现了DCs的减少,而且在重症肌无力患者进行胸腺切除手术以后,术后的DCs数量也较术前增加。因此DCs可能在重症肌无力的发生以及胸腺免疫功能中起到重要的调控作用。自噬是一种存在于真核生物中具有高度保守性的由Atg12基因参与的生理活动,研究发现自噬相关基因在胸腺瘤合并重症肌无力的肿瘤组织及外周血中较单纯胸腺瘤表达增高。因此认为胸腺瘤中DCs的自噬可能与重症肌无力的发生相关。目的:一、探究单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织中DC的自噬表达水平。二、通过体外诱导分化不同成熟状态的DCs,并和胸腺瘤细胞系共培养,探究不同成熟状态DCs的自噬表达和胸腺瘤细胞系对于树突状细胞的自噬表达影响。方法:一、选取天津医科大学总医院心胸外科2015.9.1—2016.12.30手术切除的单纯胸腺瘤(T组,20例)与胸腺瘤合并MG(T/MG组,30例)组织标本50例,免疫组织化学法检测其中Atg12、Beclin1、p62、LC3B蛋白表达情况,免疫磁珠分选(Magnetic-activated cell sorting,MACS)分离单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织中的CD11c~+DCs,流式细胞仪检测细胞纯度,Real-time PCR和Western-blot检测DCs中Atg12、Beclin1、p62、LC3B的mRNA及蛋白表达水平。二、Ficoll分离液分离10例人脐血单个核细胞,MACS分离CD34~+细胞,在含5%FBS、1%青链霉素、GM-CSF、IL-4的RMPI1640的培养条件下刺激诱导分化DCs,培养第6日收集一半未成熟树突状细胞(iDCs),同时在另一半加入TNF-α培养24h后收集成熟树突状细胞(mDCs),通过MACS检测DCs纯度,取一半iDCs和mDCs与胸腺瘤细胞系Thy0517共培养,分别将DCs接种于Transwell上室,Thy0517接种于下室,共培养3天后收集所有细胞,Western-blot和Real-time PCR检测所有DCs中Atg12、Beclin1的mRNA以及蛋白表达水平。结果:一、在50例单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并MG组织标本中,T组和T/MG组在性别、年龄、BMI指数、病理分型等方面差异均无统计学意义(P0.05);免疫组织化学结果表示:Atg12、Beclin1、LC3B在胸腺瘤合并MG(T/MG组)中的阳性表达率分别为73.3%(21/30)、70%(21/30)、63.3%(19/30),高于在单纯胸腺瘤(T组)中的阳性表达率分别为30%(6/20)、40%(8/20)、25%(5/20),差异均有统计学意义(P0.05);p62在单纯胸腺瘤(T组)和胸腺瘤合并MG(T/MG组)分别65%(13/20)和40%(12/30),差异无统计学意义(P0.05);经MACS分离CD11c~+DCs纯度达99%,Real-time PCR结果表示比较于T组,T/MG组织分离的DCs中Atg12、Beclin1、LC3B的mRNA表达升高,p62表达降低(P0.05);Western-blot结果提示T/MG组织分离的DCs较T组Atg12、LC3B、Beclin1蛋白表达升高,p62蛋白表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。二、诱导分化后的iDCs、mDCs经MACS分离CD11c~+DCs后纯度接近99%,经Thy0517共培养后,Western-blot结果表示mDCs比较于iDCs、T-mDCs比较于T-iDCs的自噬相关蛋白Atg12、Beclin1的相对表达含量均明显升高,差异有统计学意义(P0.05);同时,在单纯诱导分化和Thy0517共培养后的iDCs和mDCs中,T-iDCs比较于iDCs、T-mDCs比较于mDCs的的自噬相关蛋白Atg12、Beclin1的相对表达含量均明显升高,差异有统计学意义(P0.05);Real-time PCR结果同样表示mDCs和T-mDCs分别较iDCs和T-iDCs的Atg12、Beclin1mRNA表达升高,且T-iDCs和T-mDCs分别较iDCs和mDCs的Atg12、Beclin1mRNA表达同样升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1、胸腺瘤合并MG较单纯胸腺瘤在组织中的自噬水平明显升高,且通过高纯度分离DCs后,在DCs中的自噬表达结果与组织中相一致,说明胸腺瘤自噬尤其是组织中DCs的自噬增加与胸腺瘤合并重症肌无力的发生有一定关系。2、通过体外诱导分化的mDCs较iDCs的自噬表达增加,且与胸腺瘤细胞系共培养后,T-mDCs的自噬表达依旧高于T-iDCs,表明刺激树突状细胞成熟可能是树突状细胞自噬水平升高的主要因素。3、mDCs和iDCs在通过与胸腺瘤细胞系共培养后自噬表达均升高,因此胸腺瘤细胞共培养可以引起树突状细胞自噬增加,并可能是重症肌无力发生的相关机制之一。
【图文】：

表 1-2：自噬相关蛋白在单纯胸腺瘤与胸腺瘤合并 MG 组织中染色情：P＜0.05 认为有统计学差异。表达情况 T 组 T/MG 组 Apg12（Atg12）阳性（+） 6 22阴性（-） 14 8Beclin1阳性（+） 8 21阴性（-） 12 9p62阳性（+） 13 12阴性（-） 7 18LC3阳性（+） 5 19阴性（-） 15 11

Beclin1在T/MG组和T组胸腺瘤组织中表达情况
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.3;R746.1

【参考文献】

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1 孟媛;宋敏;许斌;;Beclin1、Bcl-2在子宫内膜癌中的研究及临床意义[J];中华临床医师杂志(电子版);2013年24期

2 李跃;王渠源;张颂婕;邵艳萍;石琪;;自噬基因ARHI与Beclin1在宫颈癌中的表达及意义[J];中华临床医师杂志(电子版);2013年23期

3 孟云霄;谢琰臣;朱小泉;李海峰;史慧静;乔杉杉;张佳s，

本文编号：2638609