黑皮质素受体—1在大鼠蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的作用及其相关机制研究

发布时间：2020-05-13 00:31

【摘要】：背景与目的:自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是神经外科最常见的急症之一,约占所有脑卒中的5%。SAH具有高致残率和高死亡率。据统计,SAH首次破裂的死亡率高达30%左右,幸存者中有8-20%的患者需要长期的护理。近几年研究发现,SAH后早期脑损伤(early beain injury,EBI)是导致SAH患者预后很差的主要原因。早期脑损伤的机制包括神经炎症,神经元凋亡,血脑屏障的破坏和氧化应激等。其中神经炎症和神经元凋亡在SAH早期脑损伤的病理生理过程中发挥了很重要的作用。黑皮质素受体-1(Melanocortin receptor-1,MC1 R)是G蛋白偶联受体,属于黑皮质素受体家族。MC1R在中枢神经系统中作用非常广泛,包括调节摄食,激素生成及性行为等。此外,MC1R的脑保护作用在近几年的研究中也得到了广泛的证实。MC1R不仅能够减少脑创伤后的炎症反应,也能够减少神经细胞的凋亡,从而减轻脑损伤。BMS-470539是MC1R高度选择性激动剂。BMS-470539通过激活MC1R,抑制下游的炎症和减少细胞凋亡。然而,MC1R和BMS-470539在SAH中的作用尚无相关报道。因此,本研究以大鼠SAH模型为基础,探索大鼠SAH模型建立后,BMS-470539是否能够通过激活MC1R,从而减轻EBI,改善大鼠的神经功能,减少死亡率。材料与方法学:本实验共使用403只成年雄性Sprague-Dawey(SD)大鼠。采用血管内穿刺法诱导蛛网膜下腔出血。术前48小时经侧脑室注射PGC-1 α siRNA(small interfering RNA)和对照小干扰RNA(scramble siRNA)。术前一个小时不同组别分别给予MSG-606,MRT-68601,selisistat 等抑制剂,术后 1 小时经鼻腔给予 BMS-470539。并比较各组间的SAH出血量评分和神经功能评分。此外,还通过rotarod实验和水迷宫实验观察BM S-470539对大鼠长期记忆和认知功能的疗效。在机制研究中,通过免疫蛋白印迹法(western blot)检测穿刺侧大脑半球MC1R,p-AMPK,TBK1,NF-κB,SIRT1,PGC-1 α,UCP2等蛋白水平。采用免疫荧光验证MC1R在小胶质细胞和神经元细胞上的表达情况。采用DHE验证细胞氧化应激的水平。采用末端标记法染色(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)和 Fluoro-Jade 染色观察神经元凋亡水平。结果:1.蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中,神经功能障碍和脑水肿在24h达到最高峰,同时神经炎症(IL-1β和TNFα)和神经元凋亡(caspase-3,Bcl-2和Bax)也在SAH 24h明显增高。2.MC1R主要表达在神经元和小胶质细胞上,其表达水平在SAH 24h达到最高峰。3.BMS-470539可以通过激活MC1R明显减轻脑水肿,改善短期神经功能障碍和长期的认知和记忆功能。4.BMS-470539激活MC1R,并进一步通过调控AMPK/TBK1/NF-κB信号通路,促进小胶质细胞向M2转化,从而减轻SAH后炎症反应,起到脑保护作用。5.MC1R的激活可以通过进一步调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路,降低细胞内氧化应激水平,保护线粒体正常功能,从而减少神经元凋亡,减轻SAH后早期脑损伤。结论:在SAH模型后,给予BMS-470539可以通过抑制神经炎症,促进小胶质细胞向M2转化,并且减少神经元的凋亡,从而减轻SAH后早期脑损伤,改善大鼠短期神经功能和长期的认知和记忆功能,从而改善SAH的预后。BMS470539可能成为今后脑卒中治疗的一种重要的药物。
【图文】：

脑损伤,机制,中枢神经系统疾病

图１．１早期脑损伤的机制。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ｅａｒｌｙ邋ｂｒａｉｎ邋ｉｎｊｕｒｙ邋（Ｃａｈｉｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．邋［２３］）．逡逑（２）邋ＭＣ１Ｒ在中枢神经系统疾病中的作用逡逑黑皮质素受体（Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，邋ＭＣＲ）属于Ｇ蛋白偶联受体，一共包括逡逑３逡逑

部分内容,实验设计,大鼠

时禁食但不禁水。逡逑２．２．２实验分组设计逡逑本实验由三部分实验组成（图２．１），使用大鼠数量１３４只，包括死亡和排除逡逑（ＳＡＨ邋ｓｃｏｒｅ邋＜７邋分）的大鼠。逡逑实验一：研究ＭＣ１Ｒ在ＳＡＨ组和假手术组大鼠脑组织中不同细胞类型表达水逡逑平的差异，以及其表达水平随时间的变化规律。３６只大鼠随机分为６组（ｓｈａｍ，逡逑ＳＡＨ后３ｈ，６ｈ，邋１２ｈ，２４ｈ，邋７２ｈ），采用＼＼４１６！１＾丨0１检测不同时间点＼１（：１尺的表逡逑达水平。此外，再取４只大鼠，，枿机分为两组：ｓｈａｍ和ＳＡＨ组（ＳＡＨ后２４ｈ）。逡逑采用免疫荧光法检测ＭＣ１Ｒ在不同脑细胞类型中的表达差异。逡逑实验二：为了观察ＢＭＳ－４７０５３９对ＳＡＨ后大鼠的脑保护作用，我们以以往的逡逑文献为基础，选取了三种药物剂量进行进一步的研究。３０只大鼠随机分为５组：逡逑ｓｈａｍ，邋ＳＡＨ邋＋邋ｖｅｈｉｃｌｅ邋（ｌＯｐｌ邋生理盐水），ＳＡＨ邋＋邋ＢＭＳ－４７０５３９邋（５０邋｜ｉｇ／ｋｇ，邋１０邋此，ＳＡＨ逡逑＋邋ＢＭＳ－４７０５３９邋（１６０邋呢／ｋｇ，１０邋４），和邋ＳＡＨ邋＋邋ＢＭＳ－４７０５３９邋（５００邋｜ｉｇ／ｋｇ，邋１０邋ｐｉ）。逡逑ＢＭＳ－４７０５３９术后一小时经鼻腔给药。ＳＡＨ邋２４邋ｈ后进行ＳＡＨ出血评分
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.35

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