类脑用于脑卒中移植治疗及人源化模型构建的研究

发布时间：2020-05-15 16:36

【摘要】：脑卒中在全球和中国分别是第二和第一致死原因及主要的致残原因,但是缺乏有效的治疗手段。目前,仅3%-5%脑卒中患者接受唯一的脑缺血药物组织型纤溶酶原激活剂治疗,而出血性脑卒中无药可治,使得脑卒中有效治疗策略的研究迫在眉睫。从人多能干细胞诱导培育获得的3D结构类脑器官,不仅可以模拟在体人脑发育进程和生理结构,而且具有与人脑相似度较高的表观基因组学特征,为脑卒中有效治疗策略的研究提供了新思路。本课题包含两部分,从脑卒中移植治疗的角度出发,类脑内的细胞种类多样、种属来源丰富、细胞数量可观、神经分化程度可控,具有一定的组织体积形态(直径最大可达4 mm),为脑卒中后移植修复、替代受损的神经细胞和脑组织提供了可能性;从脑卒中药物研发的角度出发,类脑具有与人脑较为接近的表观基因组学、皮层结构和细胞组成,为人源化脑缺血模型构建提供了较好的研究对象,有助于脑卒中潜在神经保护药的临床转化。因此,本课题拟开展类脑在脑卒中移植治疗及人源化脑缺血模型构建中的研究。(一)类脑在脑卒中移植治疗中的作用及机制研究近年来,脑卒中干细胞移植治疗策略被提出,为脑卒中患者提供再生医学治疗策略。临床前证据显示,干细胞移植加强脑卒中后的神经再生、血管新生、神经重构,降低脑梗死体积,改善神经运动功能。本课题组前期在脑卒中、干细胞和血管等研究领域具有较好的实验基础。因此,本部分课题拟在全世界首次开展类脑在脑卒中移植治疗中的作用及机制研究。1.脑损伤类脑移植供体的比较和选择通过鉴定类脑在不同培育阶段的细胞组成和细胞数量,我们发现离体培育的55天和85天类脑的细胞组成分别以神经干细胞和神经元为主,单个类脑的细胞数量均超过10~6,可作为神经干细胞或神经元组成为主的移植供体。进而,在大鼠脑创伤模型中分别移植培育55天类脑和85天类脑,发现与85天类脑移植相比,55天类脑移植表现出较好的神经保护作用、脑内细胞存活数量更多,更适合作为脑损伤移植供体,用于脑内移植研究。2.脑卒中类脑移植治疗时间窗首先,我们制备了在体脑缺血模型,即大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,发现在MCAO后6小时、7天、14天脑梗死体积逐渐增加,28天时脑梗死区的脑组织缺失形成空洞结构。为了探究脑卒中类脑移植治疗的有效时间窗,我们分别在MCAO后6小时、24小时或7天,将培育55天类脑移植到大鼠患侧运动皮层区。通过TTC染色检测脑梗死体积,神经肌肉功能和平衡木表现检测神经运动功能,发现MCAO后6小时或24小时,类脑移植均显著降低脑梗死体积,改善神经运动功能,为脑卒中类脑移植治疗时间窗提供了第一手证据。2.脑卒中类脑移植治疗作用机制在脑卒中后6小时移植培育55天类脑,我们发现脑卒中类脑移植治疗的作用机制如下:(1)通过免疫荧光检测类脑移植后的分化趋势和神经细胞谱系特征,发现类脑移植后在患侧皮层移植周围区具有多向分化潜能,通过原位分化和细胞替代模拟在体脑发育和成熟、支持脑运动皮层特异性重构、形成调节神经递质释放的神经元、实现与宿主脑之间的突触连接。(2)通过免疫荧光检测类脑移植后在宿主脑内的迁移和整合,发现来自移植类脑的细胞广泛分布于脑内不同区域,包括但不局限于同侧和对侧脑皮层、侧脑室,且沿着胼胝体由移植位点迁移到脑内深部。(3)通过免疫荧光检测和比较内源性与外源性神经再生,发现类脑移植促进神经再生,在患侧皮层移植周围区以促进外源性神经再生为主,在海马和侧脑室区以促进内源性神经再生为主。(4)通过免疫荧光标记突触连接相关蛋白,发现类脑移植增强患侧皮层移植周围区和海马区的突触重构;通过HE染色观察血管密度、免疫荧光标记血管内皮细胞增殖,发现类脑移植增加患侧皮层移植周围区的血管密度和血管新生。(5)通过TUNEL染色检测细胞凋亡、尼氏染色标记神经元存活,发现在患侧皮层移植周围区,类脑移植减少神经细胞凋亡,增加神经元存活。本部分课题从脑损伤类脑移植供体的比较和选择、脑卒中类脑移植治疗时间窗的确定、脑卒中类脑移植治疗作用机制三方面出发,首次证明脑卒中类脑移植治疗的可行性和有效性,并阐明了相关作用机制,为类脑移植作为脑卒中潜在有效的生物治疗策略提供了第一手临床前证据。(二)类脑在人源化脑缺血模型构建中的应用研究尽管脑卒中神经保护药已在上千项临床前研究和上百项临床试验中开展,但是大量神经保护剂被证明临床转化失败,使得脑卒中药物研发迫在眉睫。与脑卒中药物研究中常用的啮齿类动物相比,类脑与人脑的表观基因组学、皮层结构和细胞组成接近,种属差异小,可作为潜在的脑卒中模型制备对象,为构建人源化脑缺血模型提供了可能性。课题组前期工作证明了烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)作为脑卒中防治靶标。因此,本部分课题拟探究NAMPT潜在激活剂P7C3-A20的抗脑卒中神经保护作用;进而,使用类脑制备人源化脑缺血模型,用于包含NAMPT相关化合物在内的脑卒中潜在有效化合物测试,希望推进脑卒中神经保护药的临床转化。1.首次证明NAMPT潜在激活剂P7C3-A20具有抗脑卒中神经保护作用(1)在离体缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)轻中度损伤、重度损伤及再灌注损伤模型中,P7C3-A20减少神经元损伤,改善细胞活力。(2)在大鼠MCAO模型中,P7C3-A20降低脑梗死体积。(3)在正常和脑缺血大鼠中,P7C3-A20提升脑内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平。2.制备人源化类脑脑缺血模型类脑具有异质性,在同一培养批次内,其形态和体积不相同。将培育85天类脑根据直径大小分组后,与经典的离体脑缺血OGD模型相结合,制备人源化脑缺血模型。(1)人源化脑缺血模型中的类脑挑选标准通过LDH释放和Caspase 3活性分别检测和比较不同直径大小的类脑在相同OGD时间下的细胞损伤和细胞凋亡,我们给出了用于制备人源化脑缺血模型的类脑挑选标准,即舍弃体积较小的类脑(直径2 mm),仅选择体积适中的类脑(直径≥2 mm),用于人源化脑缺血模型制备,以确保该模型较好的平行性和可重复性。(2)人源化类脑脑缺血模型的时效关系将体积适中的类脑根据直径大小分组后,给予一系列时间梯度的OGD暴露(1-h、2-h、4-h、6-h、8-h、12-h)。通过LDH释放和Caspase 3活性分别检测细胞损伤和细胞凋亡,发现随着OGD暴露时间的延长,类脑损伤程度逐渐加重,损伤程度和缺血时间之间形成明显的时效关系,为药物测试时选择特定损伤程度的人源化脑缺血模型提供了实验参考依据。3.人源化类脑脑缺血模型中,脑缺血相关化合物的有效性和适用性(1)人源化类脑脑缺血模型中,脑缺血潜在神经保护药的有效性研究通过LDH释放和Caspase 3活性分别检测细胞损伤和细胞凋亡,发现在人源化类脑脑缺血模型中,NAMPT潜在激活剂P7C3-A20、已投入临床使用的一线脑缺血药物(依达拉奉和丁苯酞)以及脑卒中神经保护小分子化合物ZL006均显著降低细胞损伤和细胞凋亡,即在人源化脑缺血模型中具有一定的敏感性,表现出神经保护作用。(2)人源化类脑脑缺血模型中,脑缺血相关通路化合物的适用性研究通过LDH释放和Caspase 3活性分别检测细胞损伤和细胞凋亡,发现在人源化类脑脑缺血模型中,自噬抑制剂3-MA、广谱Caspase抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK和AMPA/kainate抑制剂CNQX降低细胞损伤和细胞凋亡,Bcl-2抑制剂Navitoclax增加细胞损伤和细胞凋亡,提示该模型适合但不局限用于靶向自噬、凋亡、AMPA/kainate受体等脑缺血相关通路化合物研究。本部分课题中,我们首次证明NAMPT潜在激活剂P7C3-A20的抗脑卒中神经保护作用;而后,使用类脑首次制备人源化脑缺血模型,并分析了该模型制备的类脑挑选标准、类脑损伤程度和缺血时间之间的时效关系,为脑卒中药物研究提供了一种新的测试模型;进一步,我们证明了部分脑卒中潜在神经保护药和脑缺血相关通路化合物在人源化脑缺血模型中的有效性和的适用性,为人源化脑缺血模型的应用提供了第一手实验证据,有助于推进脑卒中潜在神经保护药的临床转化。
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海军军医大学博士学位论文前 言在全球范围内，脑卒中是第二大致死原因及主要致残原因，具有发病率高、致死率高、致残率高、复发率高、医疗费用高等特点，是危害人类健康的严重疾病问题但是缺乏有效的治疗手段[1]。目前，获得 FDA 批准的脑卒中治疗药物仅有组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，tPA），用于急性缺血性脑卒中溶栓治疗[1-3]，出血性脑卒中尚无药可用。但是由于 tPA 治疗时间窗窄，受禁忌症限制，并发症危险，仅适用于 3%-5%脑卒中患者治疗。因此，脑卒中有效治疗策略亟需得到解决。

图 2 人类、黑长尾猴和大鼠的大脑冠状解剖结构图人类、黑长尾猴和大鼠的大脑绝对体积不同、脑回结构不同、白质比例不同。（图片来源于 Acta Neuropathol 2017; 133: 245 61）。课 题 组 前 期 一 系 列 工 作 证 明 了 烟 酰 胺 磷 酸 核 糖 转 移 酶 （ nicotinamidephosphoribosyltransferase, NAMPT）作为脑卒中防治新靶标。因此，本部分课题计划首次探究 NAMPT 潜在激活剂 P7C3-A20 在啮齿类动物脑卒中模型中的神经保护作用；而后，培育人源化类脑器官，首次尝试制备人源化脑缺血模型，希望可以缩短种属差异，，用于包含 NAMPT 相关化合物在内的脑卒中潜在有效药物测试，推进脑卒中有效治疗药物的临床转化。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743.3


本文编号：2665328