新型自噬抑制剂三氟拉嗪对胶质母细胞瘤放疗增敏的作用及机制研究

发布时间：2020-05-19 19:58

【摘要】：研究背景多形性胶质母细胞瘤(GBM)是颅内原发性恶性肿瘤,平均生存时间仅14.6个月。胶质母细胞瘤的生长具有较高的侵袭性,因此手术很难做到完全切除,术后辅以放疗、同步替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化疗成为GBM标准的治疗方案。放疗是一种通过作用于DNA而杀伤肿瘤细胞的治疗方式,因其较好的治疗效果和较低的治疗成本而在临床中广泛应用。然而,辐射诱导的DNA损伤可能导致一系列信号传导途径的改变,如激活DNA损伤修复,诱导自噬或细胞周期阻滞,增加了肿瘤对这种治疗的抵抗力。既往研究表明,对于放疗分割方式及剂量的调整并未使胶质母细胞瘤患者生存获益,而传统的放疗增敏剂如卡铂等,由于血脑屏障的障碍,它不能有效地到达肿瘤组织发挥作用。自噬是真核细胞中溶酶体依赖性的自我消化过程。自噬涉及许多过程,首先受损的蛋白质和功能障碍的细胞器被包裹成双层膜的自噬体,自噬体然后与溶酶体融合并被溶酶体中的各种蛋白酶降解。细胞自噬参与机体的多种活动,如适应饥饿,抵抗衰老,呈递抗原,维持遗传信息稳定等。自噬功能障碍可导致多种疾病,如神经退行性疾病,心血管疾病和肿瘤。近年来,对放疗抵抗的自噬研究越来越多。基础研究表明,放疗可以显着增加肿瘤细胞的自噬水平。因此,放射疗法引起的自噬通常被认为是细胞的保护机制,自噬抑制剂有望成为新型放疗增敏剂而增强放疗的杀伤作用。然而由于血脑屏障的存在,导致很多现存的自噬抑制剂不能够在肿瘤中达到有效治疗浓度。因此寻找一种可用于中枢神经系统的新型自噬抑制剂成为急需解决的问题。三氟拉嗪是一种经典的吩噻嗪类抗精神药物,其在临床中已经有50余年的应用历史。三氟拉嗪的主要适应症是精神分裂,能够改善行为异常患者的焦躁不安症状,还有止吐等作用。近年来,有较多的基础研究表明三氟拉嗪在治疗包括肺癌、恶性周围神经鞘瘤和白血病在内的多种恶性肿瘤中具有较好的效果。本课题拟在前期研究基础上,通过细胞计数试剂盒、EdU、免疫蛋白印记、共聚焦显微镜、透射电镜、彗星实验、RNA干扰、裸鼠原位肿瘤种植等相关分子生物学技术,分别从生物分子、细胞及动物模型水平研究探讨三氟拉嗪对胶质母细胞瘤细胞自噬及放疗敏感性的作用及相关机制。第一部分三氟拉嗪抑制胶质母细胞瘤细胞活性和增殖目的探究三氟拉嗪对胶质母细胞瘤细胞活性及增殖的影响。方法1.利用细胞计数试剂盒(Cell-Counting-Kit-8,CCK-8)分别检测不同浓度三氟拉嗪处理24小时及48小时后的胶质母细胞瘤细胞系U251、U87,原代胶质母细胞瘤细胞P3及人正常胶质细胞(Normal Human Astrocytes,NHA)的细胞活力。2.使用EdU染色检测三氟拉嗪处理前后胶质母细胞瘤细胞的增殖。结果1.三氟拉嗪能够降低胶质母细胞瘤细胞活力CCK-8结果显示三氟拉嗪在不同胶质母细胞瘤细胞系U251、U87及原代细胞P3的半抑制浓度(IC50)分别为16 μM,15 μM,15.5 μM。与胶质母细胞瘤细胞相比,人正常星形胶质细胞对三氟拉嗪不敏感,其IC50为22.5μM(P0.05)。2.三氟拉嗪可显著抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖EdU的结果显示三氟拉嗪显著抑制胶质母细胞瘤细胞系U251、U87的增殖(P0.05),并且是浓度依赖性的。结论1.三氟拉嗪能够降低胶质母细胞瘤的细胞活力。2.三氟拉嗪可抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。第二部分三氟拉嗪干扰胶质母细胞瘤细胞的自噬流目的研究三氟拉嗪对胶质母细胞瘤细胞自噬流的影响。方法1.Western blot检测不同浓度三氟拉嗪处理的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中自噬相关基因LC3B的表达。2.用三氟拉嗪或者PBS(作为对照)处理提前转染pSELECTGFP-LC3质粒的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87。然后在共聚焦荧光显微镜下观察不同处理组胶质母细胞瘤细胞中GFP荧光斑点,并进行统计分析。3.透射电子显微镜下观察并统计经过三氟拉嗪或者PBS处理后的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87内双层膜结构的自噬小体。4.Western blot检测不同浓度三氟拉嗪及自噬抑制剂巴佛洛霉素、自噬诱导剂雷帕霉素处理后自噬相关基因P62在胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中的蛋白水平。5.荧光显微镜下观察巴佛洛霉素、三氟拉嗪及PBS处理后的胶质母细胞瘤细胞U251和U87对溶酶体探针LysoTracker Red的亲和力。结果1.三氟拉嗪增加LC3B-Ⅱ蛋白水平、GFP-LC3荧光斑点和自噬体的数量蛋白质印记分析结果显示,三氟拉嗪处理后胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中自噬相关基因LC3B-Ⅱ的蛋白水平随着三氟拉嗪浓度增加而递增。激光共聚焦荧光显微镜观察下我们发现经过三氟拉嗪处理后的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87的GFP荧光斑点数目明显增加。在透射电镜下,我们发现用三氟拉嗪处理的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中双层膜结构的自噬体数目显著增加。2.三氟拉嗪增加P62蛋白水平,减少溶酶体荧光分子探针LysoTracker Red在细胞中的聚积由于自噬流阻滞后LC3B的蛋白水平也会增加,因此以上结果仍不能说明三氟拉嗪能够促进或者抑制胶质母细胞瘤细胞的自噬水平。P62作为另外一种重要的自噬相关基因,在自噬流通畅的情况下被降解减少。而P62蛋白水平的升高往往预示着自噬流被阻断。蛋白质印记分析结果显示,三氟拉嗪处理后的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中P62蛋白水平增高。而且随着三氟拉嗪浓度增加递增。并借助自噬抑制剂巴佛洛霉素和自噬诱导剂雷帕霉素,我们发现同未经药物处理的细胞相比,P62蛋白水平在三氟拉嗪给药组和巴佛洛霉素给药组中都明显升高,而雷帕霉素处理组中的P62蛋白水平降低。以前的基础研究表明巴佛洛霉素可以通过降低溶酶体酸化的程度而阻断自噬流末期。借助LysoTrackerRed,一种嗜酸性溶酶体探针,对巴佛洛霉素、三氟拉嗪处理后的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87进行染色,通过荧光显微镜我们发现三氟拉嗪和巴佛洛霉素一样能够明显降低LysoTrackerRed在细胞中的聚积。结论三氟拉嗪通过阻碍溶酶体的酸化而抑制胶质母细胞瘤细胞的自噬流。第三部分三氟拉嗪增加胶质母细胞瘤放疗敏感性的作用及机制目的探讨三氟拉嗪对胶质母细胞瘤细胞放疗敏感性的影响及潜在分子机制方法1.利用彗星实验及蛋白质印记分析检测γ-H2AX蛋白水平,评估对照组、三氟拉嗪单独处理组、单独放疗组和三氟拉嗪联合放疗组的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中的DNA损伤情况。2.分别对单独放疗组和联合治疗组放疗后2、6、12、24小时后的胶质母细胞瘤细胞进行γ-H2AX免疫荧光染色,在激光共聚焦荧光显微镜下计数每组细胞核中γ-H2AX荧光斑点的数目。3.将不同浓度三氟拉嗪处理的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87提取蛋白后,利用免疫蛋白印记检测DNA损伤修复相关基因Rad51、BRCA1、BRCA2的蛋白水平变化。4.利用同源重组检测试剂盒检测放射治疗前后胶质母细胞瘤细胞系U251和U87的同源重组效率。5.将胶质母细胞瘤细胞系U251和U87分为四个治疗组:对照组、三氟拉嗪处理组、放疗组和三氟拉嗪联合放疗组,处理完成后对四组细胞进行克隆形成实验,并利用Caspase 3/7活性测定试剂盒来检测上述不同处理组细胞的凋亡。6.组织蛋白酶B、L活性检测试剂盒检测三氟拉嗪处理前后的组织蛋白酶B、L在胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中的活性。7.蛋白质印记分析检测梯度浓度三氟拉嗪处理后胶质母细胞瘤细胞系U251和U87组织蛋白酶B和L的蛋白水平。8.使用siRNA特异性敲除胶质母细胞瘤细胞系U251和U87的组织蛋白酶L,然后利用蛋白质印记分析检测组织蛋白酶L、P62、Rad51和γ-H2AX的蛋白水平。9.利用同源重组试剂盒对比胶质母细胞瘤细胞系U251和U87敲除组织蛋白酶L前后的同源重组效率。10.构建裸鼠胶质母细胞瘤原位种植模型,分别设置PBS处理组、三氟拉嗪单独给药组、放疗组、三氟拉嗪联合放疗组,计数各组裸鼠的存活时间,裸鼠取脑进行石蜡包埋切片后对颅内肿瘤组织进行多种指标的免疫组化染色。结果1.三氟拉嗪增加放疗导致的DNA损伤程度以前的研究发现通过基因敲除或者使用自噬抑制剂后可以降低肿瘤细胞对放疗的抵抗性。为了探究三氟拉嗪是否能增加胶质母细胞瘤细胞系U251和U87的放疗敏感性,我们利用彗星实验检测对照组、三氟拉嗪单独处理组、单独放疗组和三氟拉嗪联合放疗组四组胶质母细胞瘤细胞的DNA损伤程度。结果表明,在四个处理组中,三氟拉嗪联合放疗组的DNA损伤水平最高。蛋白质印记分析检测上述不同处理组γ-H2AX的蛋白水平也有相同的发现。2.三氟拉嗪减少DNA损伤修复蛋白印记分析表明,三氟拉嗪治疗后能够显著减少胶质母细胞瘤细胞系U251和U87内DNA同源性修复相关蛋白Rad51、BRCA1、BRCA2的蛋白水平,增加DNA双链损伤标志物γ-H2AX的蛋白水平。同源重组效率检测试剂盒结果显示三氟拉嗪处理后的胶质母细胞瘤细胞系U251和U87同源重组效率下降。3.三氟拉嗪联合放疗可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖并增加细胞凋亡克隆形成实验结果显示同三氟拉嗪及放疗单独处理组相比,联合治疗组能够明显抑制细胞的增殖。并且Caspase 3/7活性检测试剂盒结果显示联合治疗组能够明显增加胶质母细胞瘤细胞系U251和U87的凋亡水平。4.三氟拉嗪降低胶质母细胞瘤细胞内组织蛋白酶活性三氟拉嗪处理后组织蛋白酶B、L在胶质母细胞瘤细胞系U251和U87中的活性显著下降。免疫蛋白印记分析显示三氟拉嗪还降低组织蛋白酶B和L的蛋白水平。5.组织蛋白酶L的沉默减少了 DNA损伤修复并抑制了自噬蛋白印记分析显示沉默组织蛋白酶L后DNA损伤修复相关因子Rad51的表达水平下降。DNA双链损伤标志物γ-H2AX的蛋白水平增加。同时自噬相关基因P62的蛋白水平增加。同源重组效率检测试剂盒结果显示敲除组织蛋白酶L后U251和U87细胞的同源重组效率下降。6.三氟拉嗪增加体内胶质母细胞瘤细胞的放疗敏感性体内实验结果显示同单独放疗及单独三氟拉嗪处理组相比,联合处理组能够显著增加荷瘤裸鼠的存活时间。免疫组化染色结果显示联合治疗组能够明显抑制胶质母细胞瘤细胞增殖,增加DNA损伤及减少DNA损伤修复能力。结论1.三氟拉嗪在体内外能够明显诱导胶质母细胞瘤放疗增敏。2.三氟拉嗪通过降低组织蛋白酶L水平抑制同源重组。
【图文】：

三氟拉嗪,胶质母细胞瘤,细胞活性

ＴＦＰ邋（ｐＭ）逦ＴＦＰ邋（ｐＭ）逡逑图１－２．三氟拉曝在体外抑制胶质母细胞瘤的细胞活性。（Ａ）和（Ｂ）给予０，邋５和１０逡逑ｐＭ的三氟拉嗪处理后，ＥｄＵ检测结果显示三氟拉嗪能够抑制胶质母细胞瘤细胞逡逑增殖，并呈浓度梯度依赖性（＊Ｐ＜邋０．０５；邋＊＊Ｐ＜邋０．０１；标尺大小为５０邋ｐｍ）。逡逑２３逡逑

胶质母细胞瘤,细胞活性,三氟拉嗪

ＴＦＰ（ｍＭ）逦ＴＦＰ（ｉｊＭ）逡逑图１－１．三氟拉嗪在体外抑制胶质母细胞瘤的细胞活性。（Ａ）和（Ｂ）在给予不同逡逑浓度的三氟拉嗪处理２４小时和４８小时后，ＣＣＫ－８检测胶质母细胞瘤细胞系Ｕ２５１逡逑和Ｕ８７、原代胶质母细胞瘤细胞Ｐ３和人星形细胞ＮＨＡ的细胞活性，结果显示三氟逡逑拉嗪能够降低胶质母细胞瘤的细胞活性，并呈现浓度梯度依赖性。同胶质母细胞逡逑瘤细胞相比，人星形细胞对三氟拉嗪的敏感性更低。逡逑ＥｄＵ逦Ｈｏｅｃｈｓｔ逦Ｍｅｒｇｅ逦ＥｄＵ逦Ｈｏｅｃｈｓｔ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦４＼邋＇邋＇邋＾逦．邋ｖ邋ｉ｝逦”１邋Ｎ逦！邋■ｗ＇．邋”逡逑ＴＦＰ邋（５ｍＭ＞逦丨卜、心Ｉ逦Ｌ邋：丨卜丨｜邋１；＇逦Ｊ逡逑ＴＦＰ邋（１０ＰＭ）邋■”二ｉ丨！＾逦｜逦ｕ．邋—逦’逦１逡逑Ｕ２５１逦Ｕ８７逡逑Ｂ逡逑Ｕ２５１逦Ｕ８７逡逑０４１逦＊？逦＾－0６ｌ逡逑Ｉ。：邋＿逦Ｉ－逦．逡逑ｉＭＭｍ逦＾：Ｂ逦￡ｍ逡逑０逦５逦１０逦０逦５逦１０逡逑ＴＦＰ邋（ｐＭ）逦ＴＦＰ邋（ｐＭ）逡逑图１－２．三氟拉曝在体外抑制胶质母细胞瘤的细胞活性。（Ａ）和（Ｂ）给予０，邋５和１０逡逑ｐＭ的三氟拉嗪处理后，ＥｄＵ检测结果显示三氟拉嗪能够抑制胶质母细胞瘤细胞逡逑增殖，并呈浓度梯度依赖性（＊Ｐ＜邋０．０５
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.4

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