HCN通道对脊髓背角胶状质神经元兴奋性突触传入的调控机制的研究
发布时间：2020-05-21 21:24
【摘要】：目的:超极化激活环核苷酸门控阳离子(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation,HCN)通道是一种病理性疼痛相关的离子通道,广泛分布于中枢神经系统,其中包括脊髓背角II层,即脊髓背角胶状质(Substantia gelatinosa,SG)区。SG区是整合外周伤害性刺激的初级中枢,在病理性疼痛的发病过程中,SG神经元的兴奋性谷氨酸能突触传入增强,造成痛觉敏感,即中枢敏化,这是自发痛和触诱发痛等症状的主要病理生理学基础。本实验研究了幼年动物中HCN通道在SG神经元兴奋性突触前末梢的表达情况,以及此通道对兴奋性突触传入的调控机制,以期为儿童病理性疼痛的临床治疗提供新的理论依据。方法:首先,采用幼年雄性SD大鼠,运用免疫组化技术,选用HCN通道四种亚型的特异性标记物Anti-HCN1-4和兴奋性轴突末梢标记物AntiVGLUT2,观察HCN1-4亚型在SG区兴奋性轴突末梢的表达情况。然后,制作SD大鼠离体脊髓横切片(厚400-500mm),运用全细胞膜片钳技术,记录SG神经元的自发性(spontaneous)或微小(miniature)兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs),观察HCN通道阻断剂ZD7288、CsCl以及激动剂forskolin(FSK)等药物对以上电流的频率和幅度的作用。最后,采用GAD67-GFP转基因小鼠(C57/BL6),分别在绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)阳性标记的GABA能神经元和GFP阴性标记的谷氨酸能神经元中,观察上述HCN通道调节药物对不同靶细胞的sEPSCs的作用。在本实验中,共采用了40只SD大鼠和20只GAD67-GFP转基因小鼠,为保证实验的可重复性,每组实验至少使用了3只大鼠或小鼠。结果:免疫组化实验发现,HCN1-4在SG区均有表达,其中HCN4亚型在兴奋性轴突末梢表达最多(23±3%),其次为HCN1(15±2%)和HCN2(14±2%),而HCN3主要分布于胞质内,在轴突末梢几乎无表达。对SD大鼠的电生理研究发现,在约53%的SG神经元中,HCN通道阻断剂ZD7288(10mM)可分别降低sEPSCs和mEPSCs的频率至用药前的63±4%和67±4%,表明其抑制了兴奋性的突触传入。相反,此通道的激动剂FSK(50mM)可显著增加mEPSCs的频率至325±34%,且该作用可被ZD7288部分阻断。随后,我们在对幼年GAD67-GFP小鼠的研究中发现,ZD7288和FSK对sEPSCs的调控作用在GFP阴性的谷氨酸能兴奋性神经元中有类似的作用,而在GFP阳性的GABA能抑制性神经元中却无明显作用。结论:综上所述,本研究发现了一种新的HCN通道介导的脊髓背角SG区痛觉回路兴奋性调控的细胞学机制,即突触前HCN通道(尤其是HCN4亚型)可调控SG神经元突触前末梢释放谷氨酸,且这些神经末梢的相对应的突触后靶点为兴奋性,而非抑制性SG神经元。
【图文】：
脊髓横切片的制备 3-5 周龄的雄性 SD 大鼠或 GAD67-GFP 小鼠，称重，予腹腔g/kg）麻醉。达到麻醉标准后，暴露大鼠（或小鼠）胸前部皮肤剑突，剪开剑突下腹肌暴露腹腔，突破膈肌并迅速离断双侧肋灌流针沿心尖方向穿刺至主动脉根部，剪开右心耳，快速用灌待基本置换出血液后，迅速剪开背部皮肤，分离脊柱两侧的肌肉，并完全浸入预充氧的 s-ACSF 冰水混合液中。以腹侧入路剪大部为中心游离出脊髓（腰 1-骶 3），于光学显微镜下剥离脊经根及软脊膜。随后立即将脊髓组织置于琼脂块上，用速干胶固定于载物台上，并迅速将其浸没于 s-ACSF 冰水混合液中。片频率为 80 Hz，速度为 0.05 mm/s，调起止位置，切取 400-5切片（图 2.1），立即用胶头滴管将切片移入 32 °C 持续充氧 液）中孵育至少 30 min，使 SG 神经元恢复至正常生理状态。
14图 3.1HCN1-4 亚型与 VGLUT2 在脊髓背角 II 层的共定位。A-D：HCN1-（4绿色）与 VGLUT2（红色）在脊髓背角 II 层的染色代表图，可见 HCN1 和 HCN4 主要呈点状染色，HCN2 多围绕胞膜一圈呈环状表达，而 HCN3 主要聚集于胞内呈团块状表达，箭头所指为共定位。E：HCN1-4 与 VGLUT2 的共染效能统计图，，提示 HCN4 的共染效能最高，其次为 HCN1 和HCN2，而 HCN3 与 VGLUT2 几乎无共染。在本图和以下各图中，误差线代表标准误（SEM），*代表 P < 0.05，**代表 P < 0.01。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
本文编号：2674925
【图文】：
脊髓横切片的制备 3-5 周龄的雄性 SD 大鼠或 GAD67-GFP 小鼠，称重，予腹腔g/kg）麻醉。达到麻醉标准后，暴露大鼠（或小鼠）胸前部皮肤剑突，剪开剑突下腹肌暴露腹腔，突破膈肌并迅速离断双侧肋灌流针沿心尖方向穿刺至主动脉根部，剪开右心耳，快速用灌待基本置换出血液后，迅速剪开背部皮肤，分离脊柱两侧的肌肉，并完全浸入预充氧的 s-ACSF 冰水混合液中。以腹侧入路剪大部为中心游离出脊髓（腰 1-骶 3），于光学显微镜下剥离脊经根及软脊膜。随后立即将脊髓组织置于琼脂块上，用速干胶固定于载物台上，并迅速将其浸没于 s-ACSF 冰水混合液中。片频率为 80 Hz，速度为 0.05 mm/s，调起止位置，切取 400-5切片（图 2.1），立即用胶头滴管将切片移入 32 °C 持续充氧 液）中孵育至少 30 min，使 SG 神经元恢复至正常生理状态。
14图 3.1HCN1-4 亚型与 VGLUT2 在脊髓背角 II 层的共定位。A-D：HCN1-（4绿色）与 VGLUT2（红色）在脊髓背角 II 层的染色代表图，可见 HCN1 和 HCN4 主要呈点状染色，HCN2 多围绕胞膜一圈呈环状表达，而 HCN3 主要聚集于胞内呈团块状表达，箭头所指为共定位。E：HCN1-4 与 VGLUT2 的共染效能统计图，，提示 HCN4 的共染效能最高，其次为 HCN1 和HCN2，而 HCN3 与 VGLUT2 几乎无共染。在本图和以下各图中，误差线代表标准误（SEM），*代表 P < 0.05，**代表 P < 0.01。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R741
【参考文献】
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1 Xiao-xue Zhang;Xiao-chun Min;Xu-lin Xu;Min Zheng;Lian-jun Guo;;ZD7288, a selective hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel blocker, inhibits hippocampal synaptic plasticity[J];Neural Regeneration Research;2016年05期
2 宋莉;宋学军;;慢性疼痛的研究模型、外周和脊髓机制及临床治疗进展[J];中国疼痛医学杂志;2015年01期
本文编号：2674925
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