microRNA-141-3p调控ATF5基因对胶质瘤细胞增殖凋亡的影响

发布时间：2020-05-24 01:06

【摘要】：脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤,胶质母细胞瘤被视为最具侵袭性的恶性胶质瘤。microRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度为19—25个核苷酸的非编码小分子RNA,通过与靶mRNA的3’非翻译区(3'-UTR)不完全互补配对,导致靶标mRNA降解或转录后翻译抑制,从而参与个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生理过程。这些miRNAs的缺失或者异常表达可能与疾病密切相关,包括肿瘤。但是miRNA引起肿瘤的发生发展的具体机制不明。本课题小组前期已检测到人巨细胞病毒HCMV感染对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响,并有数据显示HCMV感染后miR-141-3p表达量明显降低。因而,我们推测:HCMV通过调节胶质瘤细胞内miRNA的表达,影响胶质瘤中控制细胞增殖、凋亡的关键蛋白,进而调控脑胶质瘤细胞的恶性程度。本实验通过生物信息学分析发现,miR-141-3p与转录激活因子5(Activating transcription factor 5,ATF5)mRNA3’-UTR区域存在碱基互补配对。为了进一步提高预测的可靠性,我们又利用BiBiServe RNA hybrid algorithm检测miR-141及其家族成员与ATF5 3’-UTR结合的最小自由能。预测结果显示,miR-141与ATF5 3’-UTR区结合的自由能为-74.0kcal/mol,并且在种子区有连续7个核苷酸完全互补。然后,我们构建了含ATF53’-UTR区的报告质粒,应用荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-141-3p与ATF53’-UTR靶向结合。以神经胶质瘤组织样本和细胞为研究对象,荧光定量PCR检测miR-141-3p和ATF5表达水平,并检测了miR-141-3p对ATF5 mRNA和蛋白表达的影响。数据显示,miR-141-3p能够降低ATF5 mRNA和蛋白的表达。通过CCK8实验和Annexin V-PE/7-AAD方法检测胶质瘤细胞增殖能力和细胞凋亡情况,进一步发现miR-141-3p负调控ATF5,从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。我们的结果显示,miR-141-3p的种子序列对于其与ATF5 3’-UTR结合形成二级结构极为重要,这种结合作用抑制了ATF5的进一步翻译。这不仅为靶向胶质瘤治疗提供新的可能靶点,也为明确胶质瘤发生发展机制提供新的理论和实验依据。同时预示着,HCMV感染很可能利用调控多种microRNA的表达来增强肿瘤细胞的持续增殖,以便为持续感染创造条件。这将是我们课题组接下来的研究重点。
【图文】：

体系：表 3.1 PCR 反应体系 体 Master Mix (2X) 10μM） 10μM） 5℃ 5 min预变性，循环内 95 ℃ 1)；72℃延伸 10 min。取 5 μL PC3.1），PCR 扩增产物大小符合预期

图 3.3 电转装置将电转仪置于冰上，按照正负极安装电转装置，电转槽中加源，设定电流为 130mA。疫反应检测蛋白表达：取出 PVDF 膜，用 TBST 洗膜 3 次，每次 10min，，然后将膜室温封闭 2 h，封闭结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 m抗：用 5%脱脂奶粉按照抗体说明书要求稀释一抗，稀释后例加入，将置于 4℃过夜，第二天取出，置于摇床上复苏 2 BST 洗膜 3 次，每次 10 min；二抗：按照一抗的种属，加入相应 HRP 标记的山羊抗兔 IgG000 稀释），置于摇床室温孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，每次 1学发光及图像采集
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.41

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 孙海婷;;microRNA作用靶基因的预测[J];科技创新与应用;2013年23期

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1 王琛;miR-141-3p对前列腺癌LNCaP细胞生长的影响及其作用机制的探讨[D];第四军医大学;2015年

本文编号：2678227